吳瑪莉，徐莉娜，李安梅，唐莉娜，黃雨婷，檀 軍，何光志

(1貴州省疾病預(yù)控控制中心，貴陽(yáng)550004;2貴州大學(xué)動(dòng)物學(xué)專業(yè);3貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院)

并殖吸蟲寄生肺部引起的肺吸蟲病廣泛分布于亞洲、非洲及南美洲，是一種人畜共患的重要寄生蟲病，我國(guó)分布的并殖吸蟲優(yōu)勢(shì)種主要為衛(wèi)氏并殖吸蟲和斯氏貍殖吸蟲［1］。貴州省是斯氏貍殖吸蟲疫區(qū)，近年流行病學(xué)調(diào)查顯示感染發(fā)病率居高不下。李安梅等2007年對(duì)2 090例寄生蟲病住院病例的回顧性調(diào)查分析顯示，肺吸蟲病例占3.21%(67例)，僅次于蛔蟲發(fā)病率，男女比例 4.151［2］;2008年貴州省醫(yī)院門診患者送檢血清陽(yáng)性率 為18.18%，2009年上升至22.22%，送檢患者中5～14歲者占39.33% ～68.18%，且廣泛分布于全省各地。肺吸蟲病常用臨床診斷方法主要為通過(guò)ELISA檢測(cè)患者血清或胸腔積液內(nèi)的抗體［3，4］，但最佳的方法應(yīng)該既能用于早期感染潛伏期檢測(cè)，亦能在治療階段準(zhǔn)確評(píng)估藥效，這就需要尋找更敏感的診斷生物標(biāo)記物。Th2控制的免疫反應(yīng)是蠕蟲感染的一個(gè)獨(dú)有特征，但不同蟲種具體調(diào)控情況不盡相同［5］。2011年11月～2012年1月，我們對(duì)24例肺吸蟲病患者血清IL-10、IL-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1水平進(jìn)行了測(cè)定，旨在為今后檢測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)，并進(jìn)一步了解肺吸蟲感染的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對(duì)象為經(jīng)珠海海泰肺吸蟲抗體試劑盒診斷陽(yáng)性的患者共 24例，男20例(83%)，女4例(17%);兒童12例(兒童組)，成年人12例(成年組)。其中16例有生食溪蟹的習(xí)慣;6例臨床癥狀不明顯，臨床主要表現(xiàn)為胸水14例，有寄生蟲包塊癥狀的兒童患者4例。選擇4例健康志愿者作為對(duì)照組，其一般資料與上述患者具有可比性。

1.2 血清IL-10、IL-6、TGF-β1檢測(cè) 用普通生化管抽取24例患者及對(duì)照組空腹靜脈血2 mL，3 000 r/min離心5 min取上清，放20℃?zhèn)溆?。采用?lián)科生物IL-10、IL-6、TGF-β1試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，步驟如下:每孔先后加入50μL樣本稀釋液及50μL標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和對(duì)照品，再加入5μL檢測(cè)抗體，室溫孵育3 h;洗板后每孔加入100μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素孵育45 min;洗板后加入100μL顯色底物TMB孵育10～30 min，加入100μL終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上以450 nm檢測(cè)OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算直線回歸方程(r＞99%)。以各樣品所測(cè)OD值結(jié)合方程計(jì)算細(xì)胞因子濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)量數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，先進(jìn)行Levene方差齊性檢驗(yàn)，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)(P＞0.05為方差齊，反之則方差不齊);隨后進(jìn)行均值方程的t檢驗(yàn)，根據(jù)第一步所獲P值選擇相應(yīng)t值及對(duì)應(yīng)的P值，以P≤0.05或 P≤0.01為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組血清 IL-10、IL-6、TGF-β1 水平見(jiàn)圖 1。Levene方差齊性檢驗(yàn)顯示，肺吸蟲病患者成年組IL-10、IL-6、TGF-β1 水平方差齊(F=4.22，P=0.059;F=1.546，P=0.234;F=0.103，P=0.753)，與對(duì)照組比較結(jié)果均無(wú)顯著差異(t=1.37，P ＞0.05;t=0.78，P ＞0.05;t=0.63，P ＞ 0.05);兒童組 IL-10、IL-6、TGF-β1 水平方差不齊(F=1.281，P=0.227;F=1.482，P=0.244;F=0.453，P=0.512)，其中IL-10 水平顯著高于照組(t=2.94，P ＜0.05)，IL-6、TGF-β1水平與對(duì)照組比較均無(wú)顯著差異(t=1.37，P ＞0.05;t=1.40，P ＞0.05)。

圖 1 血清 IL-10、IL-6、TGF-β1 水平

3 討論

對(duì)鼠類動(dòng)物模型的研究表明，在腸道蠕蟲感染過(guò)程中Th2免疫反應(yīng)必不可少［6］，可產(chǎn)生 IL-4、IL-9、IL-10、IL-13、IL-5、IL-21 等［6，7］，此類反應(yīng)均由 Th2極化引起［9］。產(chǎn)生 Th2反應(yīng)對(duì)于蠕蟲的寄生是最基本的條件，但平衡控制此種反應(yīng)亦是必需的。這種控制由T調(diào)節(jié)(Treg)細(xì)胞完成。當(dāng)前，有幾種可能的機(jī)制被用來(lái)解釋蠕蟲感染后的抗炎癥反應(yīng)，包括 IL-10、TGF-β 和 IgG4 封閉抗體產(chǎn)生等［10，11］。寄生蟲分泌結(jié)合寄主TGF-β受體的物質(zhì)，可促進(jìn)Treg細(xì)胞分化，這些體內(nèi)抑制性的相互作用降低了感染強(qiáng)度［8］。感染了鼠鞭蟲和人蛔蟲的非洲兒童可比同地區(qū)未感染者產(chǎn)生更多的 IL-10和TGF-β［11］，而每隔5年對(duì)巴西貧困地區(qū)1 060例4～11歲感染上述兩種寄生蟲兒童血清細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果顯示，IL-10顯著升高［12］。IL-10 由 IL-4 誘導(dǎo)、TGF-β 介導(dǎo)［13，14］，具有廣泛的抗炎特性及免疫調(diào)節(jié)功能，是最初來(lái)源于Th2細(xì)胞的一個(gè)獨(dú)特產(chǎn)物，隨后發(fā)現(xiàn)其在各種淋巴細(xì)胞及骨髓細(xì)胞中表達(dá)［17］，并可通過(guò)抑制抗原遞呈細(xì)胞功能影響T細(xì)胞功能，交叉調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能。Treg細(xì)胞也分泌 IL-10［15］，故后者可能促進(jìn)更多抗炎癥表型的發(fā)展，并介導(dǎo)與這些感染相關(guān)的過(guò)敏癥狀的調(diào)節(jié)［12］。

食源性吸蟲感染可激活典型的Th2反應(yīng):①華支睪吸蟲:轉(zhuǎn)基因小鼠 FVB感染后形成囊腫，刺激與Th2反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子 IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、TGF-β 分泌增加［16］。②并殖吸蟲:斯氏貍殖吸蟲感染大鼠12周時(shí)肝組織中的IL-4增加趨勢(shì)顯著，肺吸蟲患兒治療后外周血血清中 IL-5顯著下降［17］。③肝片吸蟲:可溶性蟲卵蛋白可導(dǎo)致 TGF-β1和IL-10升高［18］。該病發(fā)病以少年兒童為主，若要篩查出可用于人群診斷的分子標(biāo)志物應(yīng)該分別研究未成年和成年患者的情況，因?yàn)槎吒腥竞笠l(fā)的免疫反應(yīng)可能有所不同。本研究顯示，除兒童組血清IL-10水平顯著高于對(duì)照組外，余肺吸蟲感染患者血清IL-10、IL-6、TGF-β1水平均與對(duì)照組無(wú)顯著差異。即血清IL-10水平僅在喜歡食用不熟溪蟹、且有典型包塊癥狀的兒童肺吸蟲感染患者中普遍升高?？赡軝C(jī)制為IL-10在兒童肺吸蟲感染中所起作用很可能是抗炎;TGF-β1的調(diào)控并非必需;可能有其他免疫分子通路參與了此類感染。本研究中肺吸蟲感染者血清IL-6水平變化不顯著，和通常的Th2反應(yīng)涉及IL-6分泌不一致，且與我們前期研究在感染大鼠血清中觀察到該因子顯著上升不同(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)未發(fā)表)，提示人類和鼠類蠕蟲感染的Th2反應(yīng)不同。故鼠模雖已廣泛用于蠕蟲免疫學(xué)研究，但不可把所有在動(dòng)物感染上獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)論擴(kuò)展至人類，如鼠類的嗜酸性細(xì)胞和人類有根本性差異，其無(wú) IgE Fc受體表達(dá)、不會(huì)很快脫?；?9］。以后應(yīng)該更針對(duì)性地關(guān)注人類感染蠕蟲后引發(fā)的免疫學(xué)變化，研究更多病例的流行病學(xué)及血清細(xì)胞因子分泌情況，以便獲取更敏感特異的診斷標(biāo)記物。

綜上所述，對(duì)具備食蟹史的兒童肺吸蟲感染患者，血清IL-10升高具有一定的潛在診斷價(jià)值。

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