張宏瑞 ,鄭永杰 ,田景芝
(1.齊齊哈爾大學(xué) 化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾 161006;2.齊齊哈爾市質(zhì)量檢測中心,黑龍江 齊齊哈爾 161006)
堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O是芳香胺類工業(yè)染料,主要用于紡織品、皮革制品及木制品的染色[1]。由于堿性橙比檸檬黃和日落黃等水溶性染料更易于在豆腐、糕點、鮮海魚上著色且不易褪色,因此,一些不法商販用堿性橙Ⅱ?qū)@類食品進(jìn)行染色[2,3]。有報道指出,過量吸入、攝取或皮膚接觸堿性橙Ⅱ可造成急性和慢性的中毒,而且相關(guān)的動物實驗表明堿性橙為致癌物[4-6]。中華人民共和國食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB2760)規(guī)定,堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O禁止用作食品添加劑[7,8]。
目前,沒有堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O檢測方法的國標(biāo)。其檢測最常采用的分析方法是高效液相色譜法[1,6,9]。許多文獻(xiàn)報道了使用高效液相色譜(HPLC)對豆制品、辣椒粉及黃魚中的堿性橙Ⅱ的分析方法[4,5,10],但是對蛋糕中堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃 O 進(jìn)行檢測的方法較少。本實驗是對HPLC檢測蛋糕中堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的前處理方法進(jìn)行優(yōu)化,通過對乙腈提取、正己烷脫脂、乙醚萃取的前處理方法進(jìn)行優(yōu)化,確定了HPLC檢測蛋糕中堿性橙含量的較佳的前處理方法。
標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma公司的堿性橙標(biāo)樣,其中包括堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O。
甲醇(色譜純);正己烷、乙酸銨、H3PO4、Na2SO4、乙腈、NH3·H2O、NaCl、乙醚(分析純)等。
Ag ilent高效液相色譜儀;二極管陣列檢測器;氮吹儀;旋渦振蕩器;離心機(jī);超聲清洗器等。
方法一:有機(jī)溶劑萃取
稱取10.0g蛋糕樣品,每10.0g樣品中堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的加標(biāo)量分別10.0mg和15.0mg,粉碎后放入125mL具塞錐形瓶中,加入乙腈和4g無水硫酸鈉后搖勻,并對其進(jìn)行超聲提取。將上清液離心(3500r·min-1,15min)。取 5.0mL提取液于 20mL試管中,用3mL正己烷渦旋萃取4次,棄去正己烷層,將其放入40℃水浴中,用氮氣吹至近干。加入2mL 2%的氨水和0.5g氯化鈉,用無水乙醚萃取3次,收集乙醚提取液,用氮氣吹干,用流動相溶解后定容到2.0mL。用0.22μm濾膜過濾后待測。
方法二:使用固相萃取柱萃取
稱取8~10g均質(zhì)后樣品,每10.0g樣品中堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的加標(biāo)量分別10.0mg和15.0mg。加入15mL甲醇,搖勻后超聲提取30min。以8000r·min-1離心10min,收集上層清液。用少量甲醇提取殘渣2次。合并提取液,在氮吹儀上吹干,加入1mL正己烷溶解。中性氧化鋁SPE小柱分別用2mL甲醇和正己烷預(yù)洗后上樣,使用20mL正己烷淋洗,使洗脫液變?yōu)闊o色,用2mL 80%的甲醇淋脫,收集淋洗液,定容至5mL,經(jīng)0.22μm濾膜過濾后,進(jìn)高效液相色譜儀進(jìn)行測定。
色譜柱為 XDB-C18(5μm,4.6mm×150mm);柱溫為30℃;檢測波長為452nm,對比波長為650nm;進(jìn)樣量為 20μL;流速:1.0mL·min-1。流動相為甲醇和0.02mol·L-1乙酸胺溶液。梯度洗脫條件:0~10min甲醇與乙酸胺溶液比例由(50∶50)洗脫到(80∶20);10~15min 甲醇與乙酸胺溶液比例為(80∶20);15~18min 甲醇與乙酸胺溶液比例由(80∶20)洗脫到(50∶50)。
所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel(2003)初步整理后,采用SPSS(11.5)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,并用LSD法進(jìn)行多重比較,數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)。
圖1是標(biāo)樣以及加標(biāo)樣品的色譜圖。
圖1 (1)標(biāo)準(zhǔn)樣品譜圖;(2)加標(biāo)后樣品的譜圖Fig.1 (1)Chromatogram of standard sample(2)Chromatogram of sample added sample
表1是方法一中乙腈使用量對堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O加標(biāo)回收率的影響,超聲時間為40min,乙醚使用量為每次3mL。
表1 乙腈使用量對堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的加標(biāo)回收率(%)的影響Tab.1 Effect of volume of acetonitrile on the recovery rate of chrysoidin and auramine O
由表1可以看出,乙腈使用量為40mL時堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的加標(biāo)回收率最高,乙腈使用量小于30mL時,其加標(biāo)回收率隨著乙腈使用量的增加而顯著增加。有報道指出乙腈具有很好的滲透性,對樣品中的色素提取完全且所含的干擾雜質(zhì)較少[8]。其他前處理條件不變,使用35mL乙醇代替乙腈時,堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的加標(biāo)回收率分別為68.42%和71.53%,顯著低于使用乙腈時的加標(biāo)回收率,88.61%和87.01%。所以,乙腈更適合用于對堿性橙的提取。
表2是方法一中超聲時間對堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O加標(biāo)回收率的影響,其中超聲時間如表所示,乙腈使用量為35mL,乙醚使用量為每次3mL。
表2 超聲時間對堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的加標(biāo)回收率(%)的影響Tab.2 Effectof the time of ultrasonic on the recovery rate of chrysoidin and auramine O
由表2可以看出,超聲時間小于50min時,堿性橙加標(biāo)回收率隨著超聲時間的增加而顯著增加;超聲時間小于30min時堿性嫩黃O加標(biāo)回收率隨著超聲時間的增加而顯著增加。其中超聲時間為50min時堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的加標(biāo)回收率最高。
方法一中使用正已烷脫脂后,使用乙醚對堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O進(jìn)行3次萃取。表3是乙醚使用量對其加標(biāo)回收率的影響,其中乙醚的使用量如表所示,乙腈使用量為每次35mL,超聲時間為40min。
表3 乙醚使用量對堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的加標(biāo)回收率(%)的影響Tab.3 Effectof volume of aether on the recovery rate of chrysoidin and auramine O
由表3可以看出,乙醚使用量為3.0mL時堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的加標(biāo)回收率最高。有報道指出乙醚對堿性橙的溶解力較強(qiáng),所以乙醚的使用量對加標(biāo)回收率的影響不大[8,10]。這與本實驗結(jié)果是一致的。
方法一是使用有機(jī)溶劑對堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O進(jìn)行萃取,方法二是使用固相萃取柱對堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O進(jìn)行萃取。本實驗是對兩種前處理方法進(jìn)行比較,其中方法一中的乙腈使用量為每次35mL,超聲時間為40min,乙醚使用量為每次3mL。結(jié)果表明,使用有機(jī)溶劑萃取法后的堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O加標(biāo)回收率分別為88.61±0.64%和87.01±1.54%。使用固相萃取法后其加標(biāo)回收率分別為81.20±0.82%和 80.01±1.73%(P<0.05),這兩種前處理方法對加標(biāo)回收率影響的差異不顯著(P>0.05)。
對堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O進(jìn)行液相色譜分析時,使用有機(jī)溶劑提取法和固相萃取法做液相前處理時,堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的加標(biāo)回收率都比較高,由于固相萃取柱的價格比較昂貴,因此,前處理時可以使用有機(jī)溶劑提取法代替固相萃取法。使用有機(jī)溶劑提取法的最佳條件為乙腈使用量為每次35mL,超聲時間為40min,乙醚使用量為3.0mL。堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的加標(biāo)回收率達(dá)到88.61%和87.01%。
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