魏然 孫艷波

【摘 要】在測定醬油中苯甲酸過程中，目標峰附近會出現(xiàn)雜質峰，干擾積分進而影響定量。本文采用超高液相色譜法，對用乙醚提取醬油中苯甲酸和用固相萃取法過濾雜質兩種提取方式進行對比。在0.01～1.0μg范圍內，苯甲酸呈良好的線性關系，相關系數（r）為1;乙醚提取法苯甲酸的回收率為91.34～99.67%，該方法涉及試劑少、處理簡單、檢測快速準確、易用于實際樣品的測定，同時加標回收率更高;固相萃取法苯甲酸的回收率為85.64～93.40%，該方法不需使用毒性大的試劑，分離效果好，基質干擾少，基線平穩(wěn)更有利于積分。同時，采用超高液相法，苯甲酸出峰在2.3min左右，相較于高效液相色譜法提速近3倍。在實際應用上適合大批量檢驗任務。

【關鍵詞】超高液相色譜法;醬油;乙醚;固相萃取

中圖分類號： O657.72;TQ460.72 文獻標識碼： A 文章編號： 2095-2457（2019）12-0011-003

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.12.005

【Abstract】During the determination of benzoic acid in soy sauce，impurity peaks appear near the target peak，which interfere with the integral and then affect the quantification.Ultra-high performance liquid chromatography（Ultra-high performance liquid chromatography） was used to compare the extraction methods of benzoic acid from soy sauce with ether and solid phase extraction（SPE）to filter impurities.In the range of 0.01-1.0 ug，the correlation coefficient（r） is 1.The recovery of benzoic acid by ether extraction method is 91.34-99.67%.This method involves less reagents， simple treatment，rapid and accurate detection，and is easy to be used for the determination of actual samples.The recovery rate of benzoic acid by solid phase extraction is 85.64-93.40%.This method does not need to be used with high toxicity.The reagent has good separation effect，less matrix interference，and stable baseline is more conducive to integration.At the same time，the peak of benzoic acid was about 2.3 minutes by ultra-high performance liquid chromatography，which was nearly three times faster than that by high performance liquid chromatography.In practical application，it is suitable for mass inspection task.

【Key words】Ultra Performance Liquid Chromatography;Soy sauce;Ether;Solid phase

醬油是我國傳統(tǒng)調味品，主要以大豆、小麥、食鹽等作為原料，經過預處理、發(fā)酵、制油等工序釀制而成。由于其中含有豐富的氨基酸、核苷酸、可溶性蛋白質、糖類等營養(yǎng)物質，細菌等微生物的侵襲會使醬油腐敗變質。為了防止醬油中微生物的繁殖，大多使用食品防腐劑苯甲酸及其鹽類。苯甲酸及其鈉鹽進入機體后，在肝臟內與甘氨酸結合形成馬尿酸， 或與葡萄糖醛酸結合形成葡萄糖苷酸，經尿排出體外。隨著現(xiàn)代食品工業(yè)的發(fā)展，食品添加劑的超量和超范圍使用現(xiàn)象十分嚴重，對食品添加劑的檢測也越來越受到人們的重視。

苯甲酸的檢測方法主要有紫外分光光度法、氣相色譜法、毛細管電泳法、高效液相色譜法，其中高效液相色譜法是檢測苯甲酸最常用的方法。由于醬油的發(fā)酵工藝產生多種有機物，采用GB5009.28-2016第一法高效液相法，按一般性試樣處理測定醬油中苯甲酸時會在目標峰前產生雜質峰，尤其是批次量大時，雜質峰會隨著樣品進針次數的增加，不斷增高，不僅影響積分定量，也會極大地降低柱效，因此，在測定前對醬油樣品進行純化處理是十分必要的。

本文采用乙醚提取苯甲酸和固相萃取過濾雜質兩種方法對醬油中苯甲酸進行提取，從精密度、穩(wěn)定性、重復性、加標回收等幾個方面展開分析并討論，以期對日常檢測起到借鑒作用。同時引入超高液相色譜法（UPLC），利用其前處理簡單、儀器精度高，分析時間更短等優(yōu)勢，增強實驗的應用性。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters超高效液相色譜儀，2695紫外檢測器，Waters empower工作站（美國Waters公司），C18柱（4.6mm×250mm，10μL），Sartorius CPA225D電子分析天平（德國賽多利斯公司），OASIS？誖HLB固相萃取小柱（3cc，60mg），Agela固相萃取裝置。

1.2 對照物質

苯甲酸標準儲備液（國家標準物質，GBW（E）100006），由中國計量科學研究院提供。

1.3 超高效液相色譜條件

色譜柱：C18 250mm×4.6mm，5～10μm;流動相：甲醇∶0.02mol/L乙酸銨溶液（5∶95）;流速：1.0mL/min;進樣量：5μL;檢測器：紫外檢測器，波長：230nm。

1.4 標準曲線的制備

使用液的制備（100mg/L）：準確移取1000mg/L儲備液1ml，至10ml容量瓶。用水定容。

標曲的配制：分別移取0mL、0.1mL、0.5mL、1mL、2mL、5mL、10mL使用液，用水定容至10mL，配制成質量濃度分別為0mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L的標準系列工作溶液。取適量標液過0.22μm濾膜，待液相色譜測定。

按1.3中的色譜條件進樣分析，以標準濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，制作標準曲線。

1.5 樣品的預處理

1.5.1 乙醚法提取樣品中苯甲酸

準確稱取醬油樣品2g于小燒杯中，滴加乙酸數滴調節(jié)pH至4～5，轉移至20ml容量瓶中，用乙醚潤洗小燒杯數次，潤洗液合并至容量瓶，用乙醚定容，振搖2min混勻。吸取1ml于試管中，水浴40℃蒸干，加2.0ml流動相溶解。取適量樣液過0.22μm濾膜，待液相色譜測定。

1.5.2 固相萃取法提取樣品中苯甲酸

準確稱取1g樣品，加水40ml，用20%磷酸調節(jié)pH至1～2，用水定容至50.0ml。取固相萃取柱加5ml甲醇活化，再加5ml水平衡小柱，然后取5.0ml樣品清液，以1.0ml/min流速通過萃取住，用5ml5%甲醇-0.1%磷酸溶液清洗萃取柱，棄去清洗液。最后用3ml甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，用水定容至10ml。取適量樣液過0.22μm濾膜，待液相色譜測定。

2 方法與結果

2.1 線性范圍的考察

精密吸取苯甲酸溶液（100mg/L）0.1μL、0.5μL、1μL、2μL、3μL、5μL、7μL、10μL。按上述色譜條件，注入高效液相色譜儀，以進樣量（X）為橫坐標，以峰面積積分值（Y）為縱坐標進行回歸，回歸方程為Y=1E+06X+15233。結果顯示，進樣量在0.01～1.0μg范圍內，回歸方程相關系數R=1，與峰面積呈良好的線性關系，見圖1。

2.2 精密度考察

精密吸取苯甲酸溶液10μL，注入超高效液相色譜儀，重復測定7次，結果RSD%為0.028%，表明精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗

取同一份樣品，分別在0、1、2、4、8、12h測定，計算苯甲酸含量的RSD%為0.016%，穩(wěn)定性良好。

2.4 空白試驗

取不含苯甲酸的樣品分別按照1.5.1，1.5.2項下方法制備試樣，測定。空白試樣中未出現(xiàn)與苯甲酸標準品保留時間相同的色譜峰，見圖。

2.5 重復性試驗

精密稱取同一樣品共6份，分別按照1.5.1，1.5.2項下方法制備試樣，測定并計算RSD%。結果乙醚提取苯甲酸平均含量0.219mg/kg，RSD%=1.77%;固相萃取提取苯甲酸平均含量0.202mg/kg，RSD%=2.75%。

2.6 加樣回收率試驗

按照1.5.1，1.5.2項下方法分別制備試樣2組，各三份，同時在稱取樣品后即在試樣中加入苯甲酸標準品，乙醚提取法加入100mg/L苯甲酸3.5ml，固相萃取法加入100mg/L苯甲酸2.5ml。測定結果，乙醚提取法苯甲酸的回收率為91.34～99.67%;固相萃取法苯甲酸的回收率為85.64～93.40%。

3 討論

參考圖5、圖6可知，乙醚提取與固相萃取兩種方法都可有效地提取目標物，適用于在測定峰附近有雜質峰樣品的測定。乙醚提取法將樣品經酸化后，用乙醚定量提取，然后取—部分提取液蒸發(fā)乙醚后定量溶解，再進行液相色譜測定。該方法涉及試劑少、處理簡單、檢測快速準確、易用于實際樣品的測定，同時加標回收率更高。采用固相萃取法測定實際樣品，不需使用毒性大的試劑，分離效果好，基質干擾少，基線平穩(wěn)更有利于積分，回收率在85.64～93.40%，也完全能滿足分析要求。

另外，本文采用了超高液相色譜法，與高效液相色譜法相比，目標峰出峰更快，參考GB 5009.28-2016附錄A中給出的色譜圖，苯甲酸出峰時間在8min左右，而采用超高液相法，苯甲酸出峰在2.3min左右，提速近3倍，大大縮短了實驗周期，節(jié)約了流動相的同時，提高了實驗的穩(wěn)定性，在實際應用上適合大批量檢驗任務。

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