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      超聲輔助萃取-高效液相色譜熒光檢測法測定貽貝中的多環(huán)芳烴

      2012-07-12 08:47:14陳雪昌孫秀梅胡紅美郭遠(yuǎn)明梅光明
      關(guān)鍵詞:貽貝環(huán)己烷檢測法

      陳雪昌,孫秀梅,胡紅美,陳 朋,郭遠(yuǎn)明,梅光明

      (浙江海洋學(xué)院海洋與漁業(yè)研究所,浙江省海洋水產(chǎn)研究所,浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室,浙江舟山 316100)

      多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)是一種持久的環(huán)境和食品有毒污染物,廣泛分布于土壤、水體、空氣、食品以及一些日常用品中。其在環(huán)境中雖含量不高,由于難以通過生物降解消除,會經(jīng)過過食物鏈逐步富集濃縮會逐漸達(dá)到相當(dāng)高的含量。因此,尋找一種簡單、快速、高靈敏的多環(huán)芳烴的分離分析技術(shù)具有重要的意義。

      目前,多環(huán)芳烴主要采用高效液相色譜法(HPLC)[1-2]、高效液相色譜質(zhì)譜法(HPLC-MS)[3],氣相色譜法(GC)[4-5]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[6]、毛細(xì)管電泳分析法(CE)[7]、薄層掃描法[8]、超臨界流體色譜法(SFC)[9]以及熒光光度法[10],分析檢測。分析對象多為大氣,水體,沉積物,魚、蝦等水產(chǎn)品。

      貽貝作為人類的食物,又是海洋食物鏈的一環(huán),有國際貽貝監(jiān)測報告[11]認(rèn)為,用貽貝作為近海污染指示物,比選擇像海藻、魚類或海水更具有代表性和價值。本文以貽貝為研究對象,建立了超聲輔助萃取-高效液相色譜熒光檢測法測定貽貝中的多環(huán)芳烴的方法。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      紫貽貝Mytilus edulis:新鮮,購自舟山市普陀?xùn)|河市場。

      1.2 主要試劑

      環(huán)己烷、二氯甲烷(農(nóng)殘級,美國J T Baker公司);甲醇、乙腈(色譜純,德國Merck公司);氫氧化鉀(優(yōu)級純,中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司);無水硫酸鈉(分析純,上海化學(xué)試劑總廠),使用前650℃烘干4 h;硫酸(優(yōu)級純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);多環(huán)芳烴混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液:分別稱取一定量的熒蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[a]芘,苯并[g,h,i]芘和茚并[1,2,3-cd]芘標(biāo)準(zhǔn)品(中國計量科學(xué)研究院),用丙酮定容至10 mL,配置成10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,4℃避光保存,使用時用流動相逐級稀釋至所需濃度。

      1.3 主要儀器與設(shè)備

      Waters Alliance高效液相色譜儀(美國Waters公司),配2695熒光檢測器;高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司);渦旋混合器(德國Ika公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司);Florisil固相萃取柱(250 mg,3 mL,德國CNW Technologies GmbH公司)。

      1.4 實驗方法

      1.4.1 樣品制備

      將紫貽貝用海水洗凈泥沙,濾干水分。用小刀剝開外殼,取出整個貽貝。稱取約250 g置于高速組織搗碎機(jī)中制成勻漿。

      1.4.2 樣品提取

      準(zhǔn)確稱取5.00 g試樣,置于50 mL聚四氟乙烯管中,加入25 mL甲醇和10 mL 50%的氫氧化鉀溶液,超聲萃取1 h(30℃)后,6 000 r/min離心5 min,提取上清液于另一50 mL聚四氟乙烯管中,加入10 mL環(huán)己烷,超聲10 min(30℃),2 000 r/min渦旋2 min,6 000 r/min離心5 min,吸取上層環(huán)己烷于125 mL分液漏斗中,下層液體再用10 mL環(huán)己烷重復(fù)萃取2次,合并環(huán)己烷層。

      環(huán)己烷萃取液依次用10 mL 50%甲醇/水溶液、5 mL水、5 mL水和1 mL 60%硫酸溶液重復(fù)振搖,靜置分層,棄去下層液體,并用30 g/L硫酸鈉水溶液洗環(huán)己烷層至中性,以達(dá)到清洗萃取液目的,將環(huán)己烷層經(jīng)無水硫酸鈉脫水后轉(zhuǎn)移至100 mL梨形瓶中,在40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(35 r/min,152 mbar),濃縮至1~2 mL即可。

      1.4.3 樣品凈化

      依次用3 mL二氯甲烷、5 mL環(huán)己烷活化Florisil固相萃取柱。將濃縮后的提取液轉(zhuǎn)移至柱子中,并依次用1 mL、2 mL環(huán)己烷清洗梨形瓶,全部轉(zhuǎn)移至柱子中;用9 mL環(huán)己烷-二氯甲烷溶液(3:1,v/v)洗脫,收集于100 mL梨形瓶中,40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(35 r/min,152 mbar)至干。準(zhǔn)確加入2 mL乙腈,充分溶解后,用0.22 μm微孔濾膜過濾,供高效液相色譜儀測定。

      1.4.4 色譜工作條件

      色譜柱:Supelcosiltm LC-PAH 柱(250 mm×4.6 mm×5.0 μm);流動相:乙腈-水(65:35,v/v);流速:1 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20 μL;以保留時間定性,外標(biāo)法-峰面積定量。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 檢測條件的選擇

      多環(huán)芳烴常用的檢測器有紫外、熒光、化學(xué)發(fā)光等方法,通常紫外檢測法靈敏度較低,而化學(xué)發(fā)光檢測法雖然無需光源、背景噪音低,檢測靈敏度高,但需要引入化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。本研究選擇操作簡單,靈敏度高的熒光檢測法。根據(jù)各化合物保留時間、最大吸收波長設(shè)定相應(yīng)的熒光條件。苯并[b]熒蒽和苯并[k]熒蒽性質(zhì)相近,選擇同一熒光條件。各多環(huán)芳烴的熒光檢測程序見表1。

      表1 6種多環(huán)芳烴的熒光檢測程序Tab.1 Fluorescence detection program for six PAHs

      2.2 色譜分離條件

      為了獲得滿意的分離度,對流動相、柱溫、流速等因素進(jìn)行了考察,得到的優(yōu)化結(jié)果見1.4.4。優(yōu)化條件下,6種多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖1。結(jié)果表明,該條件下,6種多環(huán)芳烴實現(xiàn)了很好的分離。

      圖1 6種多環(huán)芳烴(10 μg/L)標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Chromatogram of 6 kinds of PAHs standard

      2.3 萃取方式的選擇

      本試驗選擇超聲波輔助萃取法,操作簡單,萃取效率高。首先,試樣中加入皂化劑超聲處理,有效的除去脂類物質(zhì)的干擾。接著加入環(huán)己烷對皂化后的上清液超聲萃取,使親脂性的多環(huán)芳烴轉(zhuǎn)移進(jìn)入環(huán)己烷層。

      2.4 提取液凈化

      試樣經(jīng)造化萃取后,還殘留痕量的脂肪族化合物和一些極性較強(qiáng)的組分,需要進(jìn)一步凈化。采用甲醇-水體系能有效去除正己烷層中脂肪組織水解的脂蛋白。60%硫酸溶液可以有效地凈化生物樣品中脂肪和其他雜質(zhì)。

      比較了C18和Florisil柱的凈化效果,確定選擇對分離脂肪族和芳香族化合物效果較好的Florisil柱為固相萃取柱。

      2.5 工作曲線和檢出限

      用流動相稀釋多環(huán)芳烴混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,得到0.002~0.5 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按照色譜工作條件進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,6種多環(huán)芳烴在0.002~0.5 mg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,工作曲線、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。

      表2 方法線性回歸方程和檢出限Tab.2 The linear regression equations and determination limits of the proposed method

      2.6 回收率和精密度試驗

      采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對待測試樣進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度試驗,以考察方法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。對市售的紫貽貝,進(jìn)行樣品制備后,分別加入高(500 μg/kg)、中(100 μg/kg)、低(10.0 μg/kg)3 種濃度水平混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,平行測定6次,實驗結(jié)果見表3。結(jié)果表明,3個加標(biāo)濃度下,回收率為78%~92%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%~6.3%,滿足分析檢測要求。

      表3 方法的回收率和精密度試驗結(jié)果(n=6)Tab.3 Result of test of recovery and precision of the proposed method(n=6)

      3 結(jié)論

      本工作建立了超聲波輔助萃取-高效液相色譜熒光檢測法測定紫貽貝中6種多環(huán)芳烴的方法。方法靈敏,超聲萃取簡單,重現(xiàn)性好,準(zhǔn)確度高,實驗結(jié)果令人滿意,可以適用于貽貝中多環(huán)芳烴的檢測,并有望應(yīng)用于其他水產(chǎn)品中多環(huán)芳烴的檢測。

      [1]饒 竹,李 松,何 淼,等.高效液相色譜-熒光-紫外串聯(lián)測定土壤中16種多環(huán)芳烴[J].分析化學(xué),2007,35:954-958.

      [2]李先國,閻國芳,周 曉,等.固相萃取-高效液相色譜-熒光檢測法測定海水中的多環(huán)芳烴[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報,2009,30(5):1 087-1 092.

      [3]趙恒強(qiáng),陳軍輝,程紅艷,等.高效液相色譜-電噴霧銀離子誘導(dǎo)電離飛行時間質(zhì)譜定性分析高沸點多環(huán)芳烴[J].分析化學(xué),2010,38:1 599-1 603.

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      [8]厲曙光.薄層掃描法測定食物油及其加熱產(chǎn)物中多環(huán)芳烴的研究[D].南京:南京鐵道學(xué)院,1989.

      [9]孫云鵬.多環(huán)芳烴的超臨界流體色譜分離研究[J].色譜,1995,13(5):398-399.

      [10]於立軍,李耀群,睦 蔚.多環(huán)芳烴的Shpol’skii低溫?zé)晒夤庾V分析[J].光譜學(xué)與光譜分析,2002,22(5):819-821.

      [11]The international mussel watch report of a workshop sponsored by the environmental studies board commission on natural resources national research council[C].Washington D C:National Academy of Science,1980.

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