屈建航，王福芳，晏加照，胡元森，趙 江

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州450001)

水體富營養(yǎng)化一直是全球備受關(guān)注的環(huán)境污染問題．據(jù)報道磷(P)是水體富營養(yǎng)化的限制性因素［1，2］，一般認(rèn)為，水體中總磷的質(zhì)量濃度大于0．02 mg·L-1，水體即處于富營養(yǎng)化狀態(tài)［3］．沉積物作為水體系統(tǒng)的內(nèi)源P庫，構(gòu)成了水體潛在的P污染源．水-沉積物間P循環(huán)及其生物驅(qū)動機(jī)制成為控制水體富營養(yǎng)化的關(guān)鍵性研究，并以水-沉積物界面為重要位點(diǎn)［4］．沉積物中蘊(yùn)藏豐富的微生物種質(zhì)資源［5］，其中溶磷細(xì)菌(Phosphate-solubilizing bacteria)能夠?qū)⒉蝗苄粤姿猁}溶解轉(zhuǎn)化為可溶性有效磷，直接參與水體系統(tǒng)磷物質(zhì)循環(huán)．LI等［6］對富營養(yǎng)化官廳水庫沉積物的溶磷細(xì)菌垂直分布研究表明，溶磷細(xì)菌的數(shù)量與沉積物的磷含量呈正相關(guān)關(guān)系，對磷循環(huán)有重要作用．目前國內(nèi)外對溶磷細(xì)菌的研究多集中在土壤，尤其是植物根部［7］，旨在提高土壤磷的利用率，或?yàn)樯锪追实难兄铺峁┚N資源，而對沉積物中的溶磷細(xì)菌的研究相對較為薄弱．本研究以河南省鄭州市西流湖界面沉積物為對象，從中篩選溶磷細(xì)菌，鑒定種屬并研究其溶磷能力，以期探明沉積物中溶磷細(xì)菌這一特定細(xì)菌種群的生態(tài)組成，及其對水體富營養(yǎng)化的作用．

1 材料與方法

1．1 樣品來源

沉積物樣品采集自河南省鄭州市西流湖，于自封袋常溫帶回實(shí)驗(yàn)室，立即使用．對上覆水和經(jīng)3 000 r·min-1離心20 min制備的沉積物間隙水，用0．22 μm微孔濾膜過濾后，用PHS-3C酸度計測定pH值，磷鉬藍(lán)比色法［8］測定可溶性磷含量．

1．2 培養(yǎng)基

無機(jī)磷培養(yǎng)基［6］:葡萄糖 10．0 g，(NH4)2SO40．5 g，MgSO4·7H2O 0．3 g，NaCl 0．3 g，KCl 0．3 g，F(xiàn)eSO40．03 g，MnSO4·H2O 0．03 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值 7．0 ～ 7．2，115 ℃ 滅菌 30 min，無菌Ca3(PO4)210 g單獨(dú)加入．固體培養(yǎng)基加瓊脂15 g．

1．3 溶磷菌的篩選

10 g新鮮沉積物樣品，放入90 mL無菌生理鹽水中，玻璃珠震蕩制備沉積物菌懸液，10倍梯度稀釋法進(jìn)行無機(jī)磷培養(yǎng)基平板涂布，28℃培養(yǎng)。定期觀察生長及溶磷圈產(chǎn)生情況，挑取溶磷圈較大的代表性菌落，純化并保存于牛肉膏斜面培養(yǎng)基．

1．4 溶磷能力測定

1．4．1 定性測定 新鮮菌株點(diǎn)接于無機(jī)磷培養(yǎng)基平板，28℃倒置培養(yǎng)，定期觀察透明圈的大小，記錄菌落直徑(d)和溶磷圈直徑(D)，以D/d的大小定性判定溶磷能力．試驗(yàn)設(shè)置平行．

1．4．2 定量測定 100 mL無機(jī)磷培養(yǎng)基裝入300 mL三角瓶，將新鮮菌株使用不含磷源的分離培養(yǎng)基洗滌，制成種子液，2 mL接種，28℃，140 r·min-1搖床培養(yǎng)．每菌3個重復(fù)，取平均值．設(shè)置接種等量滅活菌液的對照組作為空白，以排除菌種本身攜帶以及培養(yǎng)基的基礎(chǔ)磷干擾．定期對培養(yǎng)液取樣并離心，取上清液以鉬藍(lán)比色法測定磷含量，以上清液磷含量與總磷含量的比值計算溶磷得率，所有數(shù)據(jù)去除對應(yīng)空白對照的磷量．同時使用PHS-3C酸度計，測定培養(yǎng)液的pH值變化．

1．5 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

用無菌牙簽挑取少量單菌落菌體重懸于20 μL無菌ddH2O中，沸水浴煮沸10 min，立即置于冰上 5 min，4 ℃下 12 000 r·min-1離心 5 min，使用時取1．5 μL上清液作為DNA模板;同時以1．5 μL無菌重蒸水為模版作為陰性對照．PCR擴(kuò)增引物使用原核生物16S rDNA通用引物Escherichia coli 27f和 1 495R［9］．?dāng)U增條件為 94 ℃ 3 min;94℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，30 個循環(huán);72℃ 10 min．?dāng)U增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由上海生工生物公司測定核苷酸序列．測序結(jié)果使用BLAST程序［10］與 GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列(http://www．ncbi．nlm．nih．gov/)進(jìn)行比對分析，下載相關(guān)序列，MEGA 3．1軟件［11］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹．

2 結(jié)果與分析

2．1 沉積物樣品的理化特性

取樣點(diǎn)上覆水 pH值6．56，可溶性磷含量0．020 mg·L-1，沉積物呈黑色，腥臭味，間隙水 pH值 6．85，可溶性磷含量 0．261 mg·L-1．

2．2 溶磷菌的定性篩選

定期觀察稀釋涂布的無機(jī)磷平板，結(jié)果顯示，具有不同程度大小的溶磷圈菌株，數(shù)量豐富．對溶磷圈相對較大的菌分離純化，最終初篩出4株，分別為PS-1，PS-4，PS-11和PS-13，培養(yǎng)5 d時的溶磷圈和菌落直徑結(jié)果見表1．

表1 溶磷菌的定性溶磷能力Table 1 Phosphate solubilization capacity of the strains in solid plate

2．3 溶磷能力的定量結(jié)果及pH值變化

將測試菌株接種于無機(jī)磷液體培養(yǎng)基，定期測定培養(yǎng)液上清液中的可溶性磷含量和pH值，并計算溶磷得率，結(jié)果見表2．在試驗(yàn)條件下，4株溶磷細(xì)菌從48 h開始表現(xiàn)出明顯的溶磷能力，溶磷量最高值出現(xiàn)在72 h或者96 h，其中PS-1菌溶磷能力最強(qiáng)，為 580 mg·L-1，溶磷率 28．71%;而 PS-13溶磷量相對較低，溶磷率為14．10%．溶磷細(xì)菌在固體培養(yǎng)基平板和液體培養(yǎng)條件下，表現(xiàn)出不同的相對溶磷能力．

表2 溶磷菌的溶磷能力及培養(yǎng)液pH值變化Table 2 Phosphate solubilization capacity of the strains in liquid medium and pH changes

本研究中的4株細(xì)菌在無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中的pH值，12 h之內(nèi)降到了4．0左右，其中PS-1菌株pH值下降最為明顯，在48 h時pH值降到3．5，各菌的溶磷能力均出現(xiàn)在pH值下降之后，溶出的可溶性磷含量逐漸提高，后期隨著pH值的逐步回升，可溶性磷含量出現(xiàn)明顯的下降趨勢(圖1)．pH值和溶磷率之間存在一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系．

2．4 溶磷菌的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育鑒定

對篩選獲得的溶磷細(xì)菌 PS-1，PS-4，PS-11和PS-13進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增和核苷酸測序，測得序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號分別為JN106383，JN106384，JN106385 和 JN106386．Gen-Bank BLAST比對結(jié)果表明，菌株P(guān)S-1與Pseudomonas fluorescens［12］同源性最高，為 99%，PS-4 與Pseudomonas mandelii［13］同源性最高，為 99% ，PS-11與 Pseudomonas putida［14］同源性最高，為99%，PS-13的最相近菌為 Aeromonas salmonicida［15］，同源性100%．分別下載各自的相關(guān)序列，并使用MEGA 3．1軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果顯示(圖2)，菌株P(guān)S-1，PS-4和PS-11屬于假單胞菌屬Pseudomonas sp．，PS-13 為氣單胞菌屬 Aeromonas sp．

圖1 溶磷菌在培養(yǎng)液中的溶P能力及pH值變化Fig．1 Changes of soluble phosphate content and pH value over time of strains

圖2 溶磷菌的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．2 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences of phosphate solubilizing bacteria

3 結(jié)論與討論

水-沉積物界面是水體營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)的關(guān)鍵，0～20 cm深度范圍內(nèi)的沉積物主要影響水-沉積物界面的磷循環(huán)，被認(rèn)為是廣義的界面沉積物［16］．本研究以無機(jī)磷酸鈣為磷源，從鄭州市西流湖界面小于5 cm深度的沉積物中篩選出4株高效溶磷細(xì)菌，其中 PS-1，PS-4和 PS-11屬于假單胞菌屬Pseudomonas sp．，PS-13為氣單胞菌屬 Aeromonas sp．，在無機(jī)磷培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)96 h溶出的上清液可溶性磷含量分別達(dá) 580．00，437．98，417．40，283．60 mg·L-1．界面沉積物作為水 - 沉積物間磷循環(huán)的重要位點(diǎn)，其中溶磷細(xì)菌的含量豐富，溶磷菌株的獲得及鑒定為了解其生態(tài)狀況及后續(xù)深入研究奠定了基礎(chǔ)．

當(dāng)前報道的溶解無機(jī)磷的細(xì)菌多以假單胞菌屬為主．氣單胞菌屬常見于淡水或污水，兼性厭氧，被認(rèn)為具有腸桿科菌的一些特征，部分種具有假單胞菌和弧菌屬的某些菌的特征［17］．目前多數(shù)研究者認(rèn)為pH值條件與菌株溶磷能力之間存在明顯相關(guān)，本研究中4株溶磷細(xì)菌的溶磷率和培養(yǎng)液pH值之間呈一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系，也體現(xiàn)了這一點(diǎn)．但也有研究表明，培養(yǎng)介質(zhì)pH值下降并非微生物溶磷的必要條件，有機(jī)酸是溶磷的一個方面，伴隨著呼吸作用或NH+4同化作用產(chǎn)生質(zhì)子也可使難溶性磷溶解［18］．關(guān)于微生物溶磷的詳細(xì)機(jī)理，還有待深入研究．

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