喬志偉，騰飛龍，邵曉貴

(1.安順學(xué)院 資源環(huán)境與工程學(xué)院，貴州 安順 561000；2.安順學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，貴州 安順 561000)

磷是作物生長最重要的元素之一[1]?；瘜W(xué)磷肥中能被作物直接吸收的有效磷易與土壤中的Ca2+、Fe3+、Al3+等離子結(jié)合，轉(zhuǎn)化為植物不可利用的難溶性磷酸鹽，造成化學(xué)磷肥利用率很低，目前我國農(nóng)田磷肥利用率僅為30%左右[2]。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，為了保證作物生長過程中有充足的磷素供應(yīng)，操作人員會施入過量的化學(xué)磷肥，進(jìn)而消耗大量的磷礦石，導(dǎo)致磷礦石面臨著被耗盡的危機(jī)[3]；過量的化學(xué)磷肥還會造成磷素在土壤中的累積，對農(nóng)業(yè)環(huán)境和水體富營養(yǎng)化都有直接或間接的影響[4，5]。因此，將土壤中難溶磷酸鹽轉(zhuǎn)化成植物吸收的有效磷成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，利用溶磷細(xì)菌將土壤中難溶態(tài)磷酸鹽轉(zhuǎn)化為有效磷，同時(shí)分泌促進(jìn)作物生長的物質(zhì)，對土壤磷素的有效化過程起到積極作用。對于提高化學(xué)磷肥的利用率，增加土壤中有效磷含量，減少磷素累積，增加作物產(chǎn)量等方面都具積極的作用[6～8]。

黃壤作為我國西南地區(qū)典型的地帶性土壤，集中分布在貴州、四川、重慶等地。其中，以貴州分布最為廣泛，全國25.3%的黃壤集中分布在貴州，其面積分別占貴州國土面積和土壤面積的41.9%和46.4%，是貴州主要的農(nóng)業(yè)土壤類型，在貴州農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用，該區(qū)域化學(xué)磷肥利用率較低[9]，且目前關(guān)于貴州黃壤區(qū)土壤溶磷細(xì)菌的研究資料且可利用的菌株資源都不足，本試驗(yàn)通過PVK平板培養(yǎng)法從貴州省安順市各縣區(qū)的黃壤中分離篩選溶磷細(xì)菌，并進(jìn)一步研究其溶磷特性，為該區(qū)域溶磷細(xì)菌的研究提供菌株資源，為溶磷細(xì)菌的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 土樣采集：

土樣采自于貴州省安順市各縣區(qū)農(nóng)田作物根際，采樣地種植作物為玉米，蔬菜等，采集表層土壤，土壤質(zhì)地為黃壤，將采集的土樣除去雜草、植物根系等，24 h內(nèi)用于溶磷細(xì)菌的分離和篩選。

1.1.2 培養(yǎng)基：

(1)PVK培養(yǎng)基(用于溶磷細(xì)菌的分離篩選): 葡萄糖10 g, Ca2(PO4)35 g, (NH4)2SO40.5 g, NaCl 0.2 g, KCl 0.2 g, MgSO40.1 g, FeSO4·7H2O 0.002 g, MnSO4·4H2O 0.002 g, 0.4%溴酚藍(lán)(pH6.7)10 mL, 酵母浸膏0.5 g，蒸餾水1 000 mL，固體培養(yǎng)基加18～20 g瓊脂，pH自然；(2) NBRIP培養(yǎng)基：葡萄糖10 g, Ca2(PO4)35 g, MgCl25 g, (NH4)2SO40.1 g, KCl 0.2 g, MgSO40.25 g, 蒸餾水1 000 mL，固體培養(yǎng)基20 g瓊脂，pH自然；(3)溶磷細(xì)菌保存與活化培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g, 蛋白胨10.0 g, NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，固體培養(yǎng)基加18～20 g瓊脂，pH調(diào)至7.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶磷細(xì)菌的分離篩選：

稱取10 g采集的新鮮土樣放在盛有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中，放入幾顆滅菌的小玻璃珠，在150 r·min-1搖床上振蕩30 min，用10倍逐級稀釋法稀釋至10-7，均勻涂布在PVK培養(yǎng)基平板上，倒置于培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，待菌落長出后觀察菌落周圍是否產(chǎn)生黃色的暈圈對菌株進(jìn)行初步的篩選；在NBRIP固體平板培養(yǎng)基上多次劃線純化后，挑選出平板上仍產(chǎn)生透明圈層的菌株，將其保存置于4 ℃冰箱。

1.2.2 溶磷細(xì)菌溶磷能力的測定：

將溶磷細(xì)菌活化后將菌液按照1%的接種量接種于滅過菌的NBRIP液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)，將培養(yǎng)第7 d的培養(yǎng)液于4 ℃，6 000 r·min-1的條件下離心5～8 min，取上清液1 mL用鉬銻抗比色法測定有效磷含量，每株菌株重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)置未接菌的空白對照，菌株溶磷能力即為接菌培養(yǎng)液有效磷含量與空白對照的差值。

1.2.3 溶磷細(xì)菌菌體生長量(OD600)的測定：

用移液管取培養(yǎng)好的液體發(fā)酵液5 mL于離心管中，在1 500 r·min-1的條件下離心3 min，在比色管中吸取上清液3 mL，并加入等量的1 mol·L-1的HCl, 以沒有接菌的空白培養(yǎng)液作為參比，在600 nm處比色測定菌液的光密度值，測定值即為OD600。

1.2.4 溶磷細(xì)菌16sRNA序列的測定：

采用引物7f (5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’)，1 540 r (5’-AGGAGGTGATCCAGC CGCA-3’) 建立擴(kuò)增反應(yīng)體系并測序，將獲得的DNA序列輸入GenBank，用Blast 程序與數(shù)據(jù)庫中的所有序列進(jìn)行比較分析，利用MEGA4.1的Neighbor-Joining 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.2.5 培養(yǎng)基不同葡萄糖濃度對菌株溶磷能力的影響:

在NBRIP液體培養(yǎng)基中，葡萄糖的加入量分別是1、5、10、15、20 g·L-1，其它成分不變，接菌培養(yǎng)測定菌株溶磷能力。

1.2.6 培養(yǎng)基不同硫酸銨含量對菌株溶磷能力的影響:

在NBRIP液體培養(yǎng)基中，硫酸銨的加入量分別是0.05、0.067、0.1、0.2、1.0 g·L-1，其它成分不變，接菌培養(yǎng)測定菌株溶磷能力。

1.2.7 不同碳源氮源對菌株溶磷能力的影響:

在NBRIP液體培養(yǎng)基中，分別以蔗糖、甘露醇、麥芽糖、淀粉等質(zhì)量代替葡萄糖為碳源，其它成分不變，接菌培養(yǎng)測定菌株溶磷能力，確定最佳碳源；確定最佳碳源后，以氯化銨、硝酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉為氮源替換硫酸銨(氮摩爾質(zhì)量相同)，接菌培養(yǎng)測定菌株在不同氮源條件下的溶磷能力。

1.2.8 外加磷源對菌株溶磷能力的影響:

在NBRIP液體培養(yǎng)基中, 通過外加磷酸二氫鉀調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中有效磷的濃度，使其有效磷濃度分別為0、20、40、60、80、100 mg·L-1，接種菌液，研究外加磷源不同濃度對菌株溶磷能力的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文數(shù)據(jù)采用方差分析的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，分析軟件為Excel2003和SASV8.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷細(xì)菌的篩選及溶磷能力

經(jīng)過初篩和多次劃線純化，最終得到14株溶磷能力大于395 mg·L-1的菌株，14株溶磷細(xì)菌溶磷圈及溶磷能力大小如表1所示，由表1可知14株菌株溶磷圈直徑大小在1.43～2.60 cm之間，菌株溶磷圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值介于1.73～3.00；14株菌株溶磷能力在395.30～564.07 mg·L-1，菌株W4的溶磷能力最強(qiáng)，為564.07 mg·L-1，顯著高于其它菌株(P<0.05)。14株菌株溶磷能力大小與對應(yīng)菌株溶磷圈直徑(D)、溶磷圈直徑和菌落直徑比值(D/d)之間的線性相關(guān)系數(shù)R2分別為0.1728、0.0028，相關(guān)性不顯著，因此菌落溶磷圈有無及大小僅做為初步篩選溶磷細(xì)菌的方法，不能作為衡量其溶磷能力大小的標(biāo)志。

表1 14株溶磷細(xì)菌溶磷圈及溶磷能力Table 1 Phosphorus circle and the ability dissolved phosphorus of phosphorus bacteria in tricalcium medium

注:同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note：Different small letters show significant difference at the 0.05 level in the same row. The same below.

2.2 溶磷細(xì)菌W4的16sRNA序列測定

以W4的總DNA為模板，利用細(xì)菌16S rRNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，將W4測序結(jié)果采用BLAST 軟件與Genbank 中的序列比較,W4菌株與Burkholderiasp.(HQ704712.1)及Burkholderiasp.(KX161744.1)的序列同源性均大于99%，鑒定其屬于伯克氏菌屬(Burkholderiasp.)，其系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。

圖1 溶磷細(xì)菌W4的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of phosphate solubilizing bacteria W4

2.3 菌株W4溶磷特性的研究

2.3.1 培養(yǎng)基不同葡萄糖濃度對W4溶磷能力的影響

培養(yǎng)液中不同葡萄糖濃度下W4的菌體生長量(OD600)及溶磷能力見表2。由表2可知，培養(yǎng)液中葡萄糖濃度分別為1、5、10、15、20 g·L-1時(shí)，W4的溶磷能力分別為107.61、419.38、564.07、570.20、580.06 mg·L-1。葡萄糖濃度為1 g·L-1時(shí)，菌株溶磷能力最小，培養(yǎng)液中碳源含量不足時(shí)對溶磷細(xì)菌溶磷能力影響較大，當(dāng)培養(yǎng)液中葡萄糖濃度從1 g·L-1增加到10 g·L-1時(shí)，W4溶磷能力從107.61 mg·L-1顯著增加到564.07 mg·L-1，增加了456.46 mg·L-1，可見當(dāng)培養(yǎng)液中葡萄糖濃度小于10 g·L-1時(shí)，隨著葡萄糖濃度的增加，W4溶磷能力呈顯著增加的趨勢；當(dāng)培養(yǎng)液中葡萄糖濃度從10 g·L-1增加到20 g·L-1時(shí)，W4溶磷能力從564.07 mg·L-1增加到580.06 mg·L-1，增加量僅為15.93 mg·L-1，培養(yǎng)液中葡萄糖濃度大于10 g·L-1時(shí)，隨著葡萄糖濃度的增加，W4溶磷能力增加不顯著；當(dāng)培養(yǎng)液中葡萄糖濃度大于15 g·L-1時(shí)，菌體活動產(chǎn)生的葡萄糖酸增加進(jìn)而抑制菌株的生長受到抑制。

2.3.2 培養(yǎng)基不同硫酸銨濃度對W4溶磷能力的影響

培養(yǎng)液中不同硫酸銨濃度下W4的菌體生長量(OD600)及溶磷能力見表3。由表3可知，培養(yǎng)液中硫酸銨濃度分別為0.05、0.067、0.10、0.20、1.00 g·L-1時(shí)，W4的菌體生長量(OD600)分別為0.23、0.31、0.42、0.55、0.69，溶磷能力分別為604.18、589.81、564.07、532.24、491.33 mg·L-1。當(dāng)培養(yǎng)液中硫酸銨濃度從0.05 g·L-1增加到1.00 g·L-1時(shí)，菌株W4 菌體生長量(OD600)從0.23增加到0.69，增加了0.46，呈顯著增加的趨勢，溶磷能力從604.18 mg·L-1降低到到491.33 mg·L-1，減少了112.85 mg·L-1，與表2培養(yǎng)液葡萄糖濃度對菌株生長量和溶磷能力的影響比較，碳源含量對菌株溶磷能力影響較大，氮源含量對菌體生長量影響較大。

表2不同葡萄糖濃度下菌株W4的OD600與溶磷能力

Table2 OD600and phosphate solubilizing capacity of W4 under different glucose concentrations

不同葡萄糖濃度/g·L-1Different glucose concentrationOD600溶磷能力/mg·L-1Dissolving phosphorus ability10.36±0.01b107.61±7.21c50.40±0.01a419.38±4.10b100.36±0.02b564.07±10.31a150.35±0.01b570.20±7.68a200.29±0.02c580.06±7.21a

表3不同硫酸銨濃度下菌株W4 OD600和溶磷能力

Table3 OD600and phosphate solubilizing capacity of W4 under different ammonium sulphate concentrations

不同硫酸銨濃度/g·L-1Different ammonium sulphate concentrationOD600溶磷能力/mg·L-1Dissolving phosphorus ability0.05023±0.01e604.18±10.79a0.0670.31±0.01d589.81±22.45ab0.100.42±0.02c564.07±10.31b0.200.55±0.02b532.24±18.08c1.000.69±0.03a491.33±9.35d

2.3.3 不同碳氮源對W4溶磷能力的影響

培養(yǎng)液中不同碳氮源對W4溶磷能力的影響見表4。由表4可知，W4對不同碳源的利用能力為葡萄糖>甘露醇>蔗糖>麥芽糖>淀粉，以葡萄糖為碳源，溶磷能力最強(qiáng)，為564.07 mg·L-1，顯著高于其它碳源，以淀粉為碳源，溶磷能力最低，為59.41 mg·L-1，W4對單糖利用效果最好，多糖最差；

以葡萄糖為碳源，選擇硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、硝酸鈉、硝酸鉀作為不同氮源，W4在以硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、硝酸鈉、硝酸鉀為氮源的條件下，溶磷能力分別為564.07、579.33、605.97、611.96、640.10 mg·L-1；W4以硝態(tài)氮為氮源溶磷能力顯著高于銨態(tài)氮。

表4 不同碳氮源菌株W4 的溶磷能力Table 4 Phosphate solubilizing capacity of strain W4 with different carbon and nitrogen sources

2.3.4 外加磷源濃度對W4溶磷能力的影響

外加磷源濃度對W4溶磷能力的影響見表5。由表5可知，隨著培養(yǎng)液中外加磷源濃度的增加，W4的溶磷能力呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，外加磷源濃度從0 mg·L-1增加到100 mg·L-1，W4的溶磷能力從564.07 mg·L-1下降到493.43 mg·L-1，培養(yǎng)環(huán)境中有效磷濃度對菌株溶磷能力也有一定的限制作用。

表5外加磷源濃度菌株W4溶磷能力

Table5 Phosphate solubilizing capacity of strain W4 with different added phosphorus concentration

不同磷源濃度/mg·L-1Different added phosphorus concentration溶磷能力/mg·L-1Dissolving phosphorus ability0564.07±10.31a20558.68±15.27ab40547.90±5.49b60523.06±21.46bc80510.19±7.74c100493.43±11.25c

3 討論與結(jié)論

溶磷微生物最明顯的標(biāo)志是可以在PVK固體培養(yǎng)基平板上產(chǎn)生溶磷圈，這也是目前篩選溶磷微生物最常用的方法之一，但是在試驗(yàn)篩選過程中，由于在平板上長出的菌落較多且相互之間的競爭關(guān)系，大多數(shù)菌株的溶磷能力受到抑制，并不是所有的菌株都會出現(xiàn)溶磷圈，且溶磷圈大小與溶磷能力之間是否存在相關(guān)性還有待研究，Nautial[10]、馮哲葉[11]、馬驄毓[12]等研究表明，溶磷圈的大小不能代表其溶磷能力的大小，本試驗(yàn)中14株菌株溶磷能力與溶磷圈大小之間的關(guān)系并不顯著，因此溶磷圈僅是作為識別溶磷微生物的標(biāo)志之一，在篩選溶磷能力強(qiáng)的微生物時(shí)，必須對其溶磷能力進(jìn)行培養(yǎng)測定。

培養(yǎng)液中葡萄糖濃度或者硫酸銨濃度不同時(shí)，培養(yǎng)基中的碳氮比不同，對菌株生長量及溶磷能力影響不同。試驗(yàn)研究表明W4培養(yǎng)液中氮源增加，菌體大量生長，氮源對菌體的生長有決定作用；培養(yǎng)液中碳源缺乏時(shí)，溶磷能力急劇下降，碳源對菌株溶磷能力起決定性作用，但是培養(yǎng)液中碳源濃度過高時(shí)，溶磷能力增加不明顯，菌體卻大量減少，對菌體生長起到限制作用，這是因?yàn)槿芰孜⑸锟梢苑纸馓荚串a(chǎn)酸溶解難溶態(tài)磷酸鹽，碳源濃度過多導(dǎo)致產(chǎn)酸增加，對菌株生長不利[13]。培養(yǎng)基中碳源和氮源的種類和含量通過影響產(chǎn)生有機(jī)酸的種類和濃度進(jìn)而影響其溶磷能力[14]，不同菌株對碳源和氮源的利用率不盡相同，胡山等[15]研究溶磷細(xì)菌Y3-35以葡萄糖為碳源，蛋白胨為氮源，溶磷能力最強(qiáng)。衛(wèi)星等[16]發(fā)現(xiàn)一株巨大芽孢桿菌以葡萄糖和硫酸銨為最佳碳氮源，本試驗(yàn)中W4以葡萄糖和硝酸鉀為碳氮源，溶磷能力最強(qiáng)。因此，培養(yǎng)環(huán)境中碳源、氮源的種類和濃度對于菌株的生長和溶磷能力的發(fā)揮具有重要的作用，是溶磷微生物應(yīng)用中要重點(diǎn)考慮和研究的方面。

本試驗(yàn)中W4經(jīng)鑒定屬于伯克氏菌屬(Burkholderiasp)，該菌屬在產(chǎn)脂肪酶[17]、促進(jìn)作物生長[18]、生物防治及土壤修復(fù)[19]等方面都有報(bào)道，通過本試驗(yàn)的研究，以期為黃壤溶磷微生物的研究提供菌株資源和其應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。