針?biāo)幉⒂脤?duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清E2、骨密度的影響

潘芳芳,周志華,王永平,王興轅,趙麗霞,陳華德

(1.杭州市余杭區(qū)第一人民醫(yī)院針灸科,浙江 311100;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué),杭州 310053)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)又稱Ⅰ型骨質(zhì)疏松癥,指由絕經(jīng)引起的骨量減少或(和)骨組織微結(jié)構(gòu)破壞,導(dǎo)致骨強(qiáng)度下降、骨脆性增加,極易發(fā)生骨折。臨床表現(xiàn)主要是腰背疼痛,身長變短,甚者骨折,以及因此而引起的多種并發(fā)癥。PMOP是中老年婦女的常見病、多發(fā)病,女性在50歲后可見明顯的骨質(zhì)丟失加速,40歲以上骨質(zhì)疏松癥總患病率女性為 15.7%,50～79歲人群骨質(zhì)疏松癥患病率女性為67.3%。并有較高的致殘率和致死率,是公認(rèn)的七大疾病之一。因此,絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的治療成為現(xiàn)在人類關(guān)注的焦點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

骨化三醇(羅蓋全)膠丸(0.25 mg/粒,10粒裝,上海羅氏制藥有限公司);S-E2試劑盒(USCNLIFE,中美合資武漢中美科技有限公司提供);動(dòng)態(tài)過濾雙能X線骨密度儀(美國Norland公司,NorlandXP-36);低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司,KDC-1044);酶標(biāo)比色儀(上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司,KHB ST-360);一次性無菌針灸針(由佳辰針灸器械有限公司提供,規(guī)格 0.25 mm×25 mm);韓式電針儀(北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司,型號(hào)LH202H)。

1.2 動(dòng)物

清潔級(jí)SD雌性大鼠70只,體重(200±15)g,由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 方法

1.3.1 模型制作

造模方法參照文獻(xiàn)[1,2],雌性大鼠去勢,模擬婦女絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松模型。去勢手術(shù)用 10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉滿意后,仰臥固定于手術(shù)板上,嚴(yán)格無菌操作,絡(luò)合碘消毒,并沿下腹部正中線切開皮膚,鈍性分離(筋膜、肌肉、腹膜)逐層進(jìn)入腹腔,可見乳白色組織,輕輕將之提出腹腔,即可見被包裹的粉紅色黃豆大小“桑椹樣”卵巢,分離后鉗夾、結(jié)扎,剪去雙側(cè)卵巢,檢查有無滲血,將脂肪組織送回腹腔內(nèi),分兩層間斷縫合關(guān)閉腹腔和縫合皮膚,絡(luò)合碘切口消毒,外涂青霉素粉。保溫待麻醉蘇醒。假手術(shù),麻醉及手術(shù)步驟均同上,入腹腔后,僅切除雙側(cè)卵巢附近一小塊脂肪,即止血逐層縫合。保溫待麻醉蘇醒。

1.3.2 動(dòng)物分組及處理

將70只SD雌性大鼠隨機(jī)分為造模組53只,假手術(shù)組17只。按上述方法進(jìn)行造模,術(shù)后90 d,造模組、假手術(shù)組各任取 5只檢測相應(yīng)指標(biāo)觀測造模是否成功。將48只造模組大鼠隨機(jī)分為模型組、電針組、藥物組、針?biāo)幗M,各12只;假手術(shù)組剩余11只。假手術(shù)組、模型組不行任何治療;電針組根據(jù)華興邦提供的大鼠腧穴定位和針刺方法,將所選腧穴分為兩組,第一組為腎俞(雙)、命門、懸鐘(雙),第二組為關(guān)元、子宮(雙)、足三里(雙)、三陰交(雙),兩組腧穴交替進(jìn)行針刺,每組選兩個(gè)腧穴接韓式電針儀,第一組選腎俞、懸鐘,第二組選子宮、足三里,每次接同側(cè)兩個(gè)腧穴,雙側(cè)腧穴交替進(jìn)行刺激,選用疏密波,2/100 Hz,強(qiáng)度1 mA,以肢體抖動(dòng)為度,每次15 min,每日1次,24次為1個(gè)療程,療程間休息 6 d,共治療 90 d;藥物組用骨化三醇 0.025 mg/只灌胃,每日 1次,共治療 90 d;針?biāo)幗M采用電針與藥物治療相結(jié)合,治療方法及療程同上。

1.3.3 標(biāo)本采集

末次給藥后所有大鼠禁食。24 h后,予腹腔注射麻醉后腹腔靜脈取血,在消毒試管中室溫(18～25℃)靜置 2 h后,離心 15 min(4000 r/min),取上清液于－20℃低溫冰箱保存待測;各組大鼠采血處死后,完整摘取右股骨、腰椎 L1-L4,剝離骨周圍軟組織,保護(hù)骨膜、骨附件等,用生理鹽水紗布包裹,于－20℃低溫冰箱保存,用于測骨密度。

1.3.4 觀察指標(biāo)檢測

S-E2指標(biāo)采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定;骨密度(BMD)檢測用雙能 X線骨密度診斷儀在小動(dòng)物測量軟件高分辨率模式下對(duì)大鼠腰椎和右側(cè)股骨進(jìn)行掃描測定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件,數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,多組計(jì)量資料用單因素方差分析(oneway-ANOVA),組間比較用LSD檢驗(yàn),兩組計(jì)量資料用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組動(dòng)物樣本脫落情況

假手術(shù)組、電針組、藥物組、針?biāo)幗M分別死亡大鼠1只。死亡大鼠數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)不全,棄用。

2.2 模型判定

術(shù)后90 d,造模組、假手術(shù)組各隨機(jī)抽取5只大鼠,檢測相應(yīng)指標(biāo),判斷造模是否成功。詳見表1。

表1 造模后去勢大鼠 S-E2、右側(cè)股骨及 L1-L4骨密度的變化比較 (±s)

表1 造模后去勢大鼠 S-E2、右側(cè)股骨及 L1-L4骨密度的變化比較 (±s)

注:與假手術(shù)組比較1)P＜0.05,2)P＜0.01

組別 n S-E2(Pg/mL) 右側(cè)股骨(g/cm2) L1-L4(g/cm2)假手術(shù)組 5 12.69±0.47 0.162±0.021 0.147±0.005造模組 5 11.24±0.082) 0.134±0.0051) 0.102±0.0202)

與假手術(shù)組比較,造模組S-E2降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);造模組右側(cè)股骨骨密度明顯降低(P＜0.05),L1-L4骨密度明顯降低(P＜0.01),根據(jù)以上結(jié)果判定造模成功。

2.3 治療后各觀察指標(biāo)比較

2.3.1 治療后各組大鼠S-E2水平的比較

與模型組比較,各治療組均能提高去勢后大鼠S-E2水平(P＜0.01),電針組較藥物組明顯(P＜0.05),針?biāo)幗M較電針組明顯(P＜0.05)。詳見表2。

表2 不同療法對(duì)去勢大鼠S-E2水平的影響比較 (±s)

表2 不同療法對(duì)去勢大鼠S-E2水平的影響比較 (±s)

注:與假手術(shù)組比較1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較3)P＜0.01;與電針組比較4)P＜0.05;與藥物組比較5)P＜0.01

組別 n S-E2(Pg/mL)假手術(shù)組 11 12.79±0.97模型組 12 11.21±0.252)電針組 11 11.84±0.442)3)藥物組 11 11.69±0.322)3)4)針?biāo)幗M 11 12.32±0.471)3)4)5)

2.3.2 治療后各組大鼠骨密度比較

與模型組比較,各治療組均能提高右側(cè)股骨和 L1-L4骨密度(P＜0.05),電針組較藥物組在 L1-L4骨密度改善上效果明顯(P＜0.05),針?biāo)幗M較藥物組(P＜0.05)、電針組(P＜0.05)在右側(cè)股骨和L1-L4骨密度提高上均明顯。詳見表3。

表3 不同療法對(duì)去勢大鼠右側(cè)股骨及 L1-L4骨密度的影響比較 (±s)

表3 不同療法對(duì)去勢大鼠右側(cè)股骨及 L1-L4骨密度的影響比較 (±s)

注:與假手術(shù)組比較 1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較 3)P＜0.05,4)P＜0.01;與電針組比較5)P＜0.05;與藥物組比較6)P＜0.05,7)P＜0.01

組別 n 右側(cè)股骨(g/cm2) L1-L4(g/cm2)假手術(shù)組 11 0.166±0.022 0.145±0.027模型組 12 0.110±0.0232) 0.078±0.0142)電針組 11 0.129±0.0202)3) 0.113±0.0202)4)藥物組 11 0.126±0.0142)3) 0.093±0.0142)3)5)針?biāo)幗M 11 0.146±0.0191)4)5)6) 0.129±0.0144)5)7)

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生普遍認(rèn)為是卵巢功能衰退引起雌激素(E2)的分泌降低,雌激素缺乏導(dǎo)致婦女內(nèi)分泌的紊亂為主要因素。E2降低,骨對(duì)PTH的敏感性增加,破骨細(xì)胞活性增強(qiáng),抑制成骨細(xì)胞,同時(shí)使CT通過破骨細(xì)胞的降鈣素受體抑制破骨細(xì)胞的骨吸收活動(dòng)減弱,骨吸收增加,骨量流失加速。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥可歸為中醫(yī)學(xué)“骨痿”、“骨痹”范疇。《素問·逆調(diào)論》:“腎不生則髓不能滿……所以不能凍傈者……名曰骨痹?！薄端貑枴ゐ粽摗?“腎氣熱,則腰背不舉,骨枯而髓減,發(fā)為骨痿?！?/p>

腎為先天之本,性命之根,主骨生髓藏精,固真陰而寓元陽。《素問·宣明五氣篇》明確指出:“腎主骨?！薄端貑枴ち?jié)臟象論》:“腎者,主蟄,封藏之本,精之處也;其華在發(fā),其充在骨?！爆F(xiàn)代中醫(yī)學(xué)對(duì)于中醫(yī)腎的研究表明,腎虛者多具有下丘腦-垂體-性腺軸功能減退,性腺激素分泌減少,使成骨功能下降,單位體積內(nèi)骨組織減少,最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[3]。故腎中精氣不足失于養(yǎng)骨是骨質(zhì)疏松發(fā)病的關(guān)鍵。

脾為后天之本,為人體氣血生化之源,先天之精賴后天水谷精微的不斷充養(yǎng)。《靈樞·本身》:“脾氣虛則四肢不用?！崩顤|垣認(rèn)為脾虛腎虧是骨痿發(fā)生的根本,他在《脾胃論·脾胃勝衰論》中指出:“形體勞疫則脾病……脾病則下流乘腎……則骨乏無力,是以骨痿。”現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,脾虛證產(chǎn)生的機(jī)制是胃腸道的一種虛損性功能低下或失調(diào)[4]。脾胃通過大腦-下丘腦-垂體的途徑而后才影響到腎上腺皮質(zhì)及性腺的功能[5]。鈣、磷等微量營養(yǎng)物質(zhì)在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病中有重要作用,當(dāng)脾虛時(shí),運(yùn)化功能減弱,影響其吸收而發(fā)生骨質(zhì)疏松。

本實(shí)驗(yàn)選用腎俞、命門、懸鐘調(diào)補(bǔ)先天,關(guān)元、足三里、三陰交調(diào)補(bǔ)后天,可以廣泛影響消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng),對(duì)人體產(chǎn)生整體調(diào)節(jié)作用。腎俞具有補(bǔ)腎益精壯骨作用;命門,又名“精宮”,陳士鐸在《石室秘錄》中說:“腎得命門而作強(qiáng)”,具有很強(qiáng)的培元補(bǔ)腎的作用。懸鐘穴,又名“絕骨”、“髓會(huì)”,可祛風(fēng)濕,利筋骨,養(yǎng)髓補(bǔ)血。研究表明艾灸懸鐘穴可以提高摘除雙側(cè)卵巢的模型大鼠的成骨細(xì)胞活性,使骨生成加快,病理組織檢查也證實(shí)這一點(diǎn),提示有防止骨小梁萎縮的作用[3]。關(guān)元、三陰交、足三里三穴合用,具有補(bǔ)益沖任、調(diào)理肝脾腎、益氣養(yǎng)血之功[6],研究表明,電針足三里、關(guān)元可升高圍絕經(jīng)期模型大鼠血清E2和下丘腦b-EP的含量,說明電針能良性調(diào)整圍絕經(jīng)期模型大鼠體內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)分泌改變[7]。此外,骨密度測量部位選擇主要是根據(jù)目前臨床上雙能X線測定方法最常用部位確定的,腰椎(L1-L4或 L2-L4)和股骨近段測量是主要的研究和測量骨量、骨密度的骨骼區(qū)域,測量的敏感性和準(zhǔn)確性較高。

骨化三醇是維生素D3的最重要活性代謝產(chǎn)物之一,通過對(duì)骨骼中成骨細(xì)胞活性的刺激作用而調(diào)節(jié)鈣平衡,治療骨質(zhì)疏松癥。口服本品可使腸道吸收鈣的能力恢復(fù)正常,糾正低血鈣、過高的血堿性磷酸酶和血甲狀旁腺素濃度,能減輕骨與肌肉疼痛,并矯正發(fā)生在纖維性骨炎和其他礦化不足病人中的組織學(xué)改變。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組及各治療組大鼠較假手術(shù)組S-E2明顯降低(P＜0.05),模型組、電針組、藥物組右側(cè)股骨和 L1-L4骨密度均明顯降低(P＜0.01),針?biāo)幗M右側(cè)股骨密度明顯降低(P＜0.05),腰椎骨密度有降低,但無顯著性差異(P＜0.05),充分說明去勢后大鼠骨吸收增加,骨量丟失明顯;同時(shí)三種療法均能不同程度地提高S-E2含量(P＜0.01),增加骨密度(P＜0.05),電針組在結(jié)果上顯示優(yōu)于藥物組(P＜0.05),但針?biāo)幗M大鼠 S-E2含量、骨密度的變化比較明顯,更加接近假手術(shù)組,與藥物組、電針組比較有顯著差別(P＜0.05),從而顯示出該治療方法的優(yōu)越性。電針組和針?biāo)幗M治療效果明顯,其理論可能與現(xiàn)有研究針刺調(diào)理脾腎為主能調(diào)節(jié)其下丘腦-垂體-性腺/腎上腺的功能低下,提高S-E2水平,改善患者衰老癥狀,改善機(jī)體生理功能相一致[8,9]。

綜上所述,通過以上穴位的相互配伍,達(dá)到補(bǔ)腎健脾、益精填髓壯骨的作用,通過電針、藥物并用達(dá)到恢復(fù)下丘腦-垂體-卵巢軸/腎上腺軸,糾正機(jī)體激素失衡和負(fù)鈣平衡的能力,抑制骨吸收,促進(jìn)骨形成,從而達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的作用。

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