李冬艷 張新日 劉超峰

機(jī)械通氣在提供有效呼吸支持的同時(shí)還可導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，即呼吸機(jī)所致肺損傷(ventilator induced lung injury，VILI)。已有研究表明，肺表面活性蛋白A(surfactant protein-A，SP-A)在急性肺損傷(acute lung injury，ALI)的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，但在VILI的發(fā)病中是否具有同樣的作用目前尚不完全清楚［1-2］。本研究通過(guò)觀察氨溴索對(duì)機(jī)械通氣大鼠肺組織SP-A表達(dá)水平的影響，探討SP-A在VILI發(fā)生過(guò)程中的作用機(jī)制，以及氨溴索對(duì)VILI的防治作用。

材料和方法

一、動(dòng)物模型的制備

24只雄性健康Wistar大鼠(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí))，體質(zhì)量300～380 g，隨機(jī)分為3組:①對(duì)照組:氣管切開(kāi)前5 d開(kāi)始每天上午及切開(kāi)前1 h經(jīng)腹腔注入生理鹽水4 ml/kg，未行機(jī)械通氣;②機(jī)械通氣組(mechanical ventilation group，MV組):通氣前5 d開(kāi)始每天上午及通氣前1 h經(jīng)腹腔注入生理鹽水4 ml/kg，VT30 ml/kg;③氨溴索干預(yù)組(ambroxol pretreatment group，AMB組):通氣前5 d開(kāi)始每天上午及通氣前1 h經(jīng)腹腔注入氨溴索30 mg/kg，VT30 ml/kg。采用25%烏拉坦(4 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠后行氣管切開(kāi)。MV組與AMB組大鼠均與動(dòng)物人工呼吸機(jī)(DH-150型，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠制造)相連接行機(jī)械通氣。呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)置為:I︰E:1︰3，F(xiàn)iO2:21%，RR:60次/min，通氣時(shí)間為120 min。

二、標(biāo)本收集

通氣結(jié)束后經(jīng)腹主動(dòng)脈放血處死大鼠，取左肺行支氣管肺泡灌洗術(shù)(4 ml×4次)，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)回收量不少于80%，BALF經(jīng)單層紗布過(guò)濾，靜置10 min后行瑞氏染色，光鏡下行中性粒細(xì)胞(polymorphonuctear，PMN)計(jì)數(shù);剩余BALF以3000 r/min離心10 min，取上清液－20℃凍存待測(cè)。在無(wú)菌狀態(tài)下取右肺上葉置于EP管中，－70℃冰箱保存，用于反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)。取右肺下葉用中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，用于普通病理和免疫組織化學(xué)染色。

三、BALF蛋白含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法(試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所)測(cè)定BALF蛋白含量，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

四、肺組織SP-A mRNA及其蛋白表達(dá)測(cè)定

采用RT-PCR法測(cè)定肺組織SP-A mRNA表達(dá)，方法如下:用TRIzol法提取肺組織總mRNA，以大鼠GAPDH作為內(nèi)對(duì)照。大鼠SP-A及內(nèi)參引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。SP-A上游引物:5’-TAA GTG CTG CCC TCT GAC CT-3’;下游引物:5’-AGG AGC CAT ACA TGC CAA AC-3’;反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min，94℃變性20 s，57℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，共36個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為246 bp。GAPDH 上游引物:5’-TGA ACG GGA AGC TCA CTG G-3’;下游引物:5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’;反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 2 min，94℃變性 20 s，56℃復(fù)性 30 s，72℃延伸 30 s，共 36 個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為307 bp。取PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描條帶寬度，以目的基因光密度值與內(nèi)參照光密度值的比值表示肺組織SP-A mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

采用免疫組織化學(xué)染色方法(SABC法)測(cè)定肺組織SP-A蛋白表達(dá)，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明(試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。兔抗大鼠抗體工作濃度為1︰50，以PBS(磷酸鹽緩沖液)代替一抗作陰性對(duì)照。結(jié)果判斷:陽(yáng)性染色為細(xì)胞漿呈棕黃色。在400倍光鏡下對(duì)每張組織切片隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察，采用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)每個(gè)視野的光密度值，以上述5個(gè)視野的平均值作為該組大鼠肺組織SP-A蛋白表達(dá)的相對(duì)含量。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、大鼠肺組織病理學(xué)變化

光鏡下觀察，對(duì)照組大鼠細(xì)支氣管上皮和肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間質(zhì)正常，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);MV組肺組織可見(jiàn)肺泡間質(zhì)增厚，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡破裂融合，肺泡腔內(nèi)有出血;AMB組肺組織可見(jiàn)肺間質(zhì)輕度水腫，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1～3。

圖1 對(duì)照組大鼠肺組織(HE×400)

圖2 MV組大鼠肺組織大量炎癥 細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔增厚，紅細(xì)胞滲入肺泡腔(HE×400)

圖3 AMB組大鼠肺組織少量炎癥 細(xì)胞浸潤(rùn)，輕度肺間質(zhì)水腫(HE×400)

二、BALF PMN計(jì)數(shù)及蛋白含量測(cè)定結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)組大鼠BALF PMN計(jì)數(shù)和蛋白含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示:MV組大鼠BALF PMN計(jì)數(shù)和蛋白含量均明顯高于對(duì)照組和AMB組(P＜0.01);AMB組大鼠BALF PMN計(jì)數(shù)和蛋白含量與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各實(shí)驗(yàn)組大鼠BALF PMN計(jì)數(shù)及蛋白含量測(cè)定()Table 1 The PMN counts and the protein level in BALF of rats()

表1 各實(shí)驗(yàn)組大鼠BALF PMN計(jì)數(shù)及蛋白含量測(cè)定()Table 1 The PMN counts and the protein level in BALF of rats()

注:a與對(duì)照組比較:P＜0.01;b與MV組比較:P＜0.01

三、肺組織SP-A mRNA及其蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織SP-A mRNA及其蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2和圖4～7。結(jié)果顯示，MV組大鼠肺組織SP-A mRNA及其蛋白表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組和AMB組(P值均＜0.01);AMB組大鼠肺組織SP-A mRNA及其蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 各實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織SP-A mRNA及其蛋白表達(dá)水平()Talbe 2 The expression of SP-AmRNA and SP-A in lung of rats()

表2 各實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織SP-A mRNA及其蛋白表達(dá)水平()Talbe 2 The expression of SP-AmRNA and SP-A in lung of rats()

注:a與對(duì)照組比較:P＜0.01;b與MV組比較:P＜0.01

組 別 例數(shù) SP-A mRNA表達(dá) SP-A 1.55 ± 0.14 0.33 ±0.02 MV 組 8 0.73 ± 0.77a 0.26 ±0.11a AMB 組 8 1.43 ±0.23b 0.31 ±0.01蛋白表達(dá)對(duì)照組8 b

圖4 對(duì)照組大鼠細(xì)支氣管上皮細(xì)胞SP-A蛋白表達(dá)(SABC×400)

圖5 MV組大鼠細(xì)支氣管上皮細(xì)胞SP-A蛋白表達(dá)(SABC×400)

圖6 AMB組大鼠細(xì)支氣管上皮細(xì)胞SP-A蛋白表達(dá)(SABC×400)

圖7 各組大鼠肺組織SP-A mRNA表達(dá)水平(RT-PCR法)注:M:Marker 1:對(duì)照組;2:機(jī)械通氣組;3:AMB干預(yù)組

討 論

肺泡表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant，PS)是一種由糖類、脂類及蛋白質(zhì)組成的混合物，具有多種生理功能及生物學(xué)效應(yīng)。PS主要成分之一是肺表面活性蛋白A(surfactant protein A，SP-A)，約占肺表面活性蛋白(surfactant protein，SP)總量的50%，主要由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和細(xì)支氣管非纖毛柱狀上皮細(xì)胞分泌，對(duì)維持肺泡正常結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用［3-4］。研究表明，SP-A質(zhì)和量的異常與許多肺部疾病，如慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、ALI、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARPS)、肺纖維化等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但SP-A在VILI的發(fā)病中是否具有同樣的作用目前尚無(wú)定論。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大潮氣量通氣組大鼠肺間質(zhì)明顯水腫，部分肺泡破裂融合，肺組織內(nèi)大量PMN浸潤(rùn)，BALF中蛋白含量明顯升高，而肺內(nèi)SP-A表達(dá)水平明顯降低。其機(jī)制可能是:①大潮氣量機(jī)械通氣直接損傷Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，使SP-A合成和分泌減少;②肺內(nèi)PMN活化后釋放的彈性蛋白酶不但可使Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞變性、壞死，還可直接降解SP-A，導(dǎo)致其含量下降［5］;③炎癥因子如TNF-α等通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性，使細(xì)胞內(nèi)SP-A mRNA及其蛋白表達(dá)減少［6］;④過(guò)氧化物一方面通過(guò)阻止轉(zhuǎn)錄因子TTF1與SP-A調(diào)控區(qū)的DNA結(jié)合，使SP-A合成減少，另一方面又可與SP-A發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，使其蛋白構(gòu)型發(fā)生改變，活性降低［7］。

研究顯示，SP-A不但具有降低肺泡表面張力和維持肺內(nèi)自身免疫的作用，還能對(duì)抗和清除炎癥因子、過(guò)氧化物和蛋白水解酶，對(duì)肺組織具有一定保護(hù)作用，故SP-A質(zhì)、量及功能的改變可加劇肺內(nèi)炎癥反應(yīng)，從而形成惡性循環(huán)。因此，通過(guò)減少SP-A破壞，上調(diào)SP-A的表達(dá)，促進(jìn)PS的合成，對(duì)VILI的防治應(yīng)具有重要意義。

氨溴索是具有多種生物學(xué)效應(yīng)的化痰劑。近年來(lái)研究表明，大劑量氨溴索對(duì)急性肺損傷有一定的保護(hù)作用［8-9］。其機(jī)制有三方面:①促進(jìn)肺泡表面活性物質(zhì)生成，降低肺泡表面張力;②減少過(guò)氧化物生成，減輕肺部氧化性損傷;③抑制炎癥細(xì)胞在肺內(nèi)聚集、活化和釋放炎癥因子，減輕過(guò)度炎癥反應(yīng)對(duì)肺組織的破壞作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AMB組大鼠SP-A mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于MV組，說(shuō)明大劑量氨溴索可通過(guò)直接或間接途徑減少SP-A的破壞，促進(jìn)SP-A表達(dá)從而減輕肺組織損傷，對(duì)VILI的發(fā)生發(fā)展具有一定的保護(hù)作用。

總之，SP-A是VILI的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要因素之一，氨溴索可通過(guò)減少SP-A的破壞，促進(jìn)SP-A表達(dá)而減輕呼吸機(jī)所致肺組織損傷，對(duì)VILI的防治有積極作用。

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