吳 強(qiáng)，何惠燕，傅艷妮，劉 玲，曹銘輝

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1.麻醉科、2.消毒供應(yīng)中心，廣東廣州 510120)

嗎啡依賴的機(jī)制非常復(fù)雜，關(guān)聯(lián)到許多調(diào)控因素，其中谷氨酸能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)發(fā)揮了重要作用［1］。細(xì)胞外液缺乏谷氨酸(glutamate，Glu)失活的水解酶系統(tǒng)，神經(jīng)末梢釋放的谷氨酸需要神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞上的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體重?cái)z取至胞內(nèi)，從而消除谷氨酸能的信號(hào)傳遞作用。興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3(excitatory amino-acid transporter 3，EAAT3)是神經(jīng)元特異性的，在調(diào)控Glu攝取速度及Glu受體的功能、調(diào)節(jié)γ-氨基丁酸(GABA)的濃度、保護(hù)神經(jīng)元方面均發(fā)揮重要作用［2－3］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)嗎啡精神依賴及復(fù)吸大鼠前額葉皮層EAAT3蛋白表達(dá)水平下降［4］，但其機(jī)制未明。本研究使用C6細(xì)胞體外模擬嗎啡成癮、戒斷、復(fù)吸過程，探討嗎啡暴露對(duì)C6細(xì)胞EAAT3蛋白表達(dá)水平的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料試劑 大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(購(gòu)于中山大學(xué)動(dòng)物中心);鹽酸嗎啡注射液(沈陽第一制藥公司，批號(hào):000355);多克隆兔抗EAAT3(Alpha Diagnostic International，USA);β-actin 抗體(Amersham，Sweden);HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(Amersham，Sweden);HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗(Amersham，Sweden)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 使用含10%新生牛血清和100 KU·L－1青－鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)C6細(xì)胞，置于37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分組后，分別按每孔2 ml、108個(gè)·L－1細(xì)胞濃度，種于6孔板上。分別加入不同濃度的嗎啡處理細(xì)胞，使得C6細(xì)胞在提取蛋白前，細(xì)胞間有80% ～100%融合。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟 ① 培養(yǎng)好的C6細(xì)胞分為5組:Control、0.01、0.1、1 、10 μmol·L－1組，分別使用0、0.01、0.1、1、10 μmol·L－1嗎啡作用48 h，Western blot檢測(cè)EAAT3蛋白表達(dá)水平，選擇對(duì)EAAT3蛋白表達(dá)影響最明顯的濃度用于下一步的細(xì)胞復(fù)吸模型。② 將 C6細(xì)胞分為 4組:Control、24、48、96 h組，各組嗎啡作用時(shí)間分別為0、24、48、96 h，作用濃度為步驟①選擇的嗎啡最佳暴露濃度，Western blot檢測(cè)EAAT3蛋白表達(dá)水平，選擇對(duì)EAAT3蛋白表達(dá)影響最明顯的暴露時(shí)間用于下一步的復(fù)吸模型。③ 將 C6細(xì)胞分為6組:Control、Mor 48 h、Ex 3 h、Ex 6 h、Ex 12 h、Ex 24 h組。使用步驟①和步驟②選擇的最佳暴露濃度和最佳暴露時(shí)間處理細(xì)胞，然后用不含嗎啡的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞模擬嗎啡戒斷過程。具體用藥如下:Control組為不加藥物組，Mor 48 h 組為 10 μmol·L－1嗎啡作用 48 h，Ex 3 h、Ex 6 h、Ex 12 h、Ex 24 h 組分別為 10 μmol·L－1嗎啡作用48 h 后停藥3、6、12、24 h。Western blot檢測(cè) EAAT3蛋白表達(dá)水平，選擇最佳戒斷時(shí)間用于下一步的復(fù)吸模型。④ 將細(xì)胞分為6組:Control、Mor 48 h、Ex 12 h、Re 2、Re 4、Re 8 h 組。C6 細(xì)胞依次經(jīng)過嗎啡暴露、戒斷、再次暴露(嗎啡劑量為第1次給藥的1/2)，Western blot檢測(cè)嗎啡多次暴露對(duì)EAAT3蛋白表達(dá)變化的影響，模擬嗎啡復(fù)吸過程。具體用藥如下:Control組為不加藥物;Mor 48 h組 10 μmol·L－1嗎啡，作用時(shí)間為 48 h;Ex12 h 組為 10 μmol·L－1嗎啡預(yù)處理48 h 停藥12 h;Re 2、Re 4、Re 8 h 組分別為 10 μmol·L－1嗎啡預(yù)處理 48 h、停藥12 h 后復(fù)處理2、4、8 h。⑤ 將細(xì)胞分為4組:Control、Mor(嗎啡)、NAL(納洛酮)、NAL+Mor(納洛酮加嗎啡)組。Control組為不加藥組，Mor組為 10 μmol·L－1嗎啡預(yù)處理 48 h、、停藥12 h 后5 μmol·L－1嗎啡復(fù)處理4 h，NAL+Mor組在嗎啡再次暴露前15min使用非選擇性阿片受體阻滯劑納洛酮(1 μmol·L－1)，其余處理同Mor組。NAL組只使用納洛酮(1μmol·L－1)。觀察在嗎啡重新暴露前15min使用納洛酮對(duì)EAAT3蛋白表達(dá)變化的影響。

1.4 Western blot步驟 用冰冷的PBS洗細(xì)胞3次，加適量細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，用細(xì)胞刮匙將細(xì)胞刮下來，超聲破碎細(xì)胞?；靹蚣?xì)胞5s。細(xì)胞液于4℃以12 000×g速度離心30 min，轉(zhuǎn)移上清液于新的EP管中。BCA法測(cè)定樣品的蛋白含量，用10%SDS－聚丙酰胺凝膠分離蛋白，30 μg/well樣品蛋白100 V電泳90 min。然后將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜，轉(zhuǎn)膜電壓為100 V，時(shí)間1 h。5% 的脫脂奶粉溶液于封閉1 h，多克隆兔抗EAAT3(1∶2 000)4℃孵育過夜，TBST緩沖液沖洗3次，辣根過氧化物酶標(biāo)二抗，室溫孵育1 h，TBST緩沖液沖洗3次，ECL曝光，高敏感X線片顯色。用program Image J(version 1.35)進(jìn)行相對(duì)灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度嗎啡作用于C6細(xì)胞48 h對(duì)C6細(xì)胞EAAT3蛋白水平的影響 0.01、0.1、1、10 μmol

·L－1嗎啡分別作用于C6細(xì)胞48 h，Western blot結(jié)果示 10 μmol·L－1組 C6 細(xì)胞 EAAT3 蛋白表達(dá)明顯較對(duì)Control組減少(P＜0.05)，見Fig 1。

Fig 1 Effects of different concentrations of morphine on the expression of EAAT3 in C6 cells(n=4)

2.2 10 μmol·L-1嗎啡作用不同時(shí)間對(duì)C6細(xì)胞EAAT3蛋白表達(dá)水平的影響 10 μmol·L－1嗎啡分別作用于C6細(xì)胞24、48、96 h后，免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示作用時(shí)間為48、96 h時(shí)EAAT3蛋白表達(dá)水平較Control組均明顯減少(P＜0.05)，見Fig 2。

Fig 2 Effects of 10 μmol·L-1morphine with different action time on the expression of EAAT3 in C6 cells(n=4)

2.3 嗎啡作用于C6細(xì)胞誘導(dǎo)EAAT3蛋白表達(dá)下調(diào)后停藥不同時(shí)間EAAT3表達(dá)回升的時(shí)間依賴性10 μmol·L－1嗎啡作用于 C6 細(xì)胞48 h 后 EAAT3蛋白表達(dá)較 Control組明顯減少(P＜0.05)，停藥12、24 h時(shí) EAAT3蛋白表達(dá)水平較嗎啡作用48 h組明顯增加(P＜0.05)，與Control組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見Fig 3。

2.4 嗎啡預(yù)處理C6細(xì)胞停藥后、復(fù)處理C6細(xì)胞不同時(shí)間EAAT3表達(dá)改變的時(shí)間依賴性 10 μmol·L－1嗎啡預(yù)處理 C6 細(xì)胞48 h、及復(fù)處理2、4、8 h EAAT3蛋白表達(dá)均減少，其中復(fù)處理4、8 h時(shí)較Control組明顯減少(P＜0.05)，見 Fig 4。

2.5 納洛酮對(duì)慢性嗎啡暴露戒斷后重新暴露C6細(xì)胞EAAT3蛋白表達(dá)的影響 C6細(xì)胞依次經(jīng)過慢性嗎啡暴露48 h、戒斷12 h、重新暴露4 h后EAAT3蛋白表達(dá)較Control組明顯下降(P＜0.05);在嗎啡重新暴露前15 min使用非選擇性阿片受體阻滯劑納洛酮(1 μmol·L－1)與嗎啡共同作用4 h后可明顯抑制嗎啡重新暴露引起的EAAT3表達(dá)下降(P＜0.05)。與Control組相比，僅使用非選擇性阿片受體阻滯劑納洛酮對(duì)EAAT3蛋白表達(dá)水平無明顯影響(P＞0.05)，見Fig 5。

Fig 3 Effects of different extinction time after 10 μmol·L-1 morphine treated for 48 h on the expression of EAAT3 in C6 cells(n=4)

Fig 4 Effects of retreatment for different time after 10 μmol·L-1 morphine pretreated on the expression of EAAT3 in C6 cells(n=4)

3 討論

C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞可內(nèi)生性地表達(dá)EAAT3和多種阿片受體［5－6］，常被用作研究EAAT3表達(dá)水平調(diào)控機(jī)制的工具細(xì)胞。本研究使用C6細(xì)胞依次經(jīng)過嗎啡暴露、停藥、小劑量嗎啡再次暴露的過程，模擬嗎啡成癮、戒斷、復(fù)吸的行為，探討EAAT3蛋白表達(dá)水平改變參與嗎啡成癮及復(fù)吸的可能機(jī)制。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 μmol·L－1嗎啡首次暴露48 h 可明顯下調(diào)C6細(xì)胞EAAT3蛋白表達(dá)，至少停用嗎啡12 h EAAT3蛋白表達(dá)回升至正常水平，C6細(xì)胞再次暴露于5 μmol·L－1嗎啡作用4 h即可引起 EAAT3蛋白表達(dá)明顯減少。本研究提示C6細(xì)胞EAAT3蛋白表達(dá)水平在嗎啡暴露后呈時(shí)間依賴性變化，而且二次嗎啡暴露時(shí)EAAT3蛋白表達(dá)下降所需嗎啡劑量減少、暴露時(shí)間縮短。

Fig 5 Effects of naloxone on the expression of EAAT3 in C6 cells treated by chronic morphine exposure，abstinence and reexposure(n=4)

CPP建立－消退－復(fù)燃模型是目前常用的研究藥物復(fù)吸的動(dòng)物模型［7］。一般 5 ～10 mg·kg－1嗎啡腹腔注射訓(xùn)練7－10 d可建立CPP模型，標(biāo)志藥物精神依賴的形成。而CPP已消退的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物只需2.5 mg·kg－1嗎啡腹腔注射，15 min后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試CPP即可復(fù)燃［8］。本研究使用C6細(xì)胞二次嗎啡暴露時(shí)嗎啡劑量減小、暴露時(shí)間明顯縮短，與動(dòng)物成癮復(fù)吸模型的嗎啡暴露條件一致。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)C6細(xì)胞EAAT3的蛋白表達(dá)水平在嗎啡二次暴露后仍呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴性改變，提示嗎啡反復(fù)使用引起的成癮或復(fù)吸可明顯下調(diào)EAAT3的蛋白表達(dá)，暴露次數(shù)越多，EAAT3的蛋白表達(dá)下調(diào)的速度越快。這說明其蛋白表達(dá)水平改變可能是嗎啡反復(fù)使用而導(dǎo)致成癮后復(fù)吸的重要機(jī)制之一。

EAAT3是神經(jīng)元上主要的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，其表達(dá)水平降低必然影響其清除突觸間隙興奮性氨基酸的功能。大量的實(shí)驗(yàn)證明嗎啡耐受及依賴后谷氨酸失衡，如海洛因誘發(fā)的復(fù)吸模型中發(fā)現(xiàn)伏核核心部Glu的含量增加。同時(shí)研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)Glu遞質(zhì)系統(tǒng)及其受體的激活可以通過增加NAc的多巴胺(DA)釋放強(qiáng)化中樞興奮劑等藥物的獎(jiǎng)賞效應(yīng)，促進(jìn)藥物濫用，而阻斷內(nèi)源性Glu的分泌可抑制嗎啡誘導(dǎo)的腹側(cè)被蓋區(qū)中DA釋放的增加、拮抗嗎啡的獎(jiǎng)賞效應(yīng)，抑制嗎啡CPP的形成［9］。而作為唯一快速有效清除谷氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)或功能改變必將影響細(xì)胞的生理功能而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的病變。我們的結(jié)果提示嗎啡反復(fù)給藥對(duì)谷氨酸重?cái)z取能力的影響，是通過改變了谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。與我們的研究結(jié)果類似，其他實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果也證實(shí)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)能力明顯影響嗎啡耐受及依賴。Nakagawa等［10］發(fā)現(xiàn)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的激動(dòng)劑MS-153可以抑制嗎啡的成癮。嗎啡慢性處理后，脊髓內(nèi)EAAT3和GLAST的表達(dá)下降［11］。雖然在嗎啡成癮形成中不同的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體其改變及作用不盡相同。但總體上而言，加強(qiáng)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能往往可延緩嗎啡耐受及依賴的形成。因此，開發(fā)可用于臨床的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體增強(qiáng)劑，可能會(huì)為嗎啡成癮后復(fù)吸的防治帶來希望。

關(guān)于慢性嗎啡處理C6細(xì)胞EAAT3表達(dá)下降的機(jī)制，有報(bào)道顯示［5］EAAT3表達(dá)下調(diào)為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，1 μmol·L－1納洛酮作用 48 h 可逆轉(zhuǎn) 10 μmol·L－1嗎啡誘導(dǎo)的EAAT3表達(dá)下降，提示嗎啡是通過作用于阿片受體，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路降低EAAT3表達(dá)。而我們研究發(fā)現(xiàn)C6細(xì)胞在嗎啡二次暴露前15 min使用1 μmol·L－1納洛酮4h即可逆轉(zhuǎn)嗎啡二次暴露引起的EAAT3表達(dá)下降，提示阿片受體在嗎啡多次暴露引起的神經(jīng)元可塑性中起重要作用。關(guān)于各種阿片受體在調(diào)控嗎啡誘導(dǎo)EAAT3表達(dá)改變中的具體作用目前少有報(bào)道。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，μ受體在嗎啡誘導(dǎo)的CPP行為和自身給藥行為過程中起主要作用，δ受體對(duì)其起調(diào)節(jié)作用［12］。因C6細(xì)胞表達(dá)μ受體較多，δ受體數(shù)量較少［6］。推測(cè)嗎啡誘導(dǎo)的C6細(xì)胞EAAT3表達(dá)下降可能主要通過μ受體起作用。但δ受體是目前報(bào)道的唯一對(duì)皮層神經(jīng)元由Glu引起的傷害有保護(hù)作用的阿片受體［13］，δ受體激活及表達(dá)對(duì)EAAT3清除谷氨酸的能力具有調(diào)節(jié)作用。因此各種阿片受體對(duì)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控作用將有待進(jìn)一步研究。

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