張建新，丁艷艷，李蘭芳，劉 芳，張勤增，解麗君，郝 娜

(河北省醫(yī)學科學院，河北 石家莊 050021)

研究顯示，急性心肌缺血和心肌梗死等心血管疾病有細胞凋亡現(xiàn)象存在［1］。細胞凋亡是按細胞的固有基因程序進行的一種生理現(xiàn)象，不同于一般病理情況下的細胞死亡，是機體為維護內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，通過基因調(diào)控和酶促反應進行的細胞程序化死亡。近些年來研究發(fā)現(xiàn)，硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)在機體內(nèi)發(fā)揮著廣泛的生物學效應，本研究室前期實驗表明，大鼠在急性心肌缺血過程中內(nèi)源性H2S的含量明顯下降，心肌組織CSE活性明顯降低，線粒體功能受損，給予H2S可明顯減輕心肌缺血損傷，改善心功能和線粒體功能，從而有效保護缺血的心?。?－3］。但是其對缺血心肌細胞凋亡的影響尚未見報道。本實驗觀察了H2S供體—硫氫化鈉(NaHS)對大鼠急性心肌缺血后心肌細胞凋亡率、caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達的影響，旨在進一步探討H2S對缺血受損心肌的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 NaHS、溴化乙啶(ethidium bromide，EB)，美國Sigma公司?？捡R斯亮藍試劑盒購自南京建成生物工程研究所。兔抗活化型caspase-3單抗，武漢博士德。鼠抗Bcl-2單抗、鼠抗Bax單抗、丙烯酰胺、N，N-亞甲雙丙烯酰胺，美國Santa Cruz公司。免疫組化檢測試劑盒、DAB試劑盒、辣根酶標記山羊抗兔購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.2 儀器 電動勻漿器(Silentcrusher M，德國Heidolph公司)。電泳儀(DYY-Ⅲ7B型)。水浴式電轉(zhuǎn)膜儀(DYY-Ⅲ40B型)。顯微鏡(Olympus BX40型)。低溫高速離心機(德國Eppendorf)。流式細胞儀(Epics-XLⅡ型)。

1.3 實驗動物 健康♂Sprague-Dawley(SD)大鼠，8～10周齡，體質(zhì)量(270±20)g，由河北省實驗動物中心提供。

1.4 模型制備及動物分組

1.4.1 大鼠急性心肌缺血模型制備 將大鼠用10%水合氯醛350 mg·kg－1腹腔注射麻醉，取仰臥位固定，剪去胸前手術(shù)區(qū)毛，碘酒消毒，用血管鉗沿第4肋間鈍性分離肋間肌約3 cm長，打開胸腔，撐開4、5肋骨剪開心包膜將心臟輕輕擠出，在左心耳與肺動脈圓錐之間平左心耳下緣迅速結(jié)扎冠狀動脈左前降支近段，立即關(guān)閉胸腔擠出胸腔內(nèi)的氣體，以恢復負壓，幫助大鼠恢復自主呼吸。將肌肉層和皮膚分別縫合，制備急性心肌缺血模型。

1.4.2 動物分組與給藥 健康成年♂ SD大鼠40只隨機分為5組，每組8只，分別為:① 假手術(shù)組;②缺血組;③ 缺血 +NaHS低劑量組;④ 缺血 +NaHS中劑量組;⑤缺血+NaHS高劑量組。缺血組結(jié)扎左冠狀動脈前降支3 h時腹腔注射2 ml·kg－1生理鹽水，缺血+NaHS低、中、高劑量組分別于結(jié)扎左冠狀動脈前降支3 h時腹腔注射0.78、1.56和3.12 mg·kg－1的NaHS(用時現(xiàn)用生理鹽水配置，均為2 ml·kg－1)，假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，各組大鼠均于結(jié)扎左冠狀動脈前降支6h時處死，取心臟備用。取心尖部分心肌置于10%甲醛溶液中固定用于免疫組化法檢測;置于 －80℃冰箱保存，進行Western blot分析;置于70%的乙醇溶液中固定用于FCM測定。

1.5 檢測指標和方法

1.5.1 流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測心肌細胞凋亡 于實驗結(jié)束后取心尖部，剪碎，70%冷乙醇固定。棄去固定組織的70%酒精，生理鹽水沖洗心肌組織塊，在100目的不銹鋼網(wǎng)上研磨，邊研磨邊用PBS沖洗于容器中，用200目銅網(wǎng)過濾并收集懸液，1 000 r·min－1，離心 10 min，棄上清，用 PBS 制成單細胞懸液。應用美國Beckman-Coulter公司生產(chǎn)的Epics-XLⅡ型流式細胞儀，激發(fā)光源300 mW氬離子激光器，激發(fā)波長488 nm，檢測前調(diào)整儀器CV值在2%以內(nèi)。每個樣本檢測10 000個細胞，以DNA組方圖出現(xiàn)低于G1期DNA含量的亞G1峰的大小代表凋亡細胞的多少，用Expo32 ADC軟件分析處理免疫熒光數(shù)據(jù)，計算凋亡百分率。

1.5.2 Western blot檢測 caspase-3蛋白表達 將裂解的心肌組織離心，上清液與點樣緩沖液熱變性，做聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用吐溫-PBS洗滌，5%脫脂奶粉封閉，加稀釋的caspase-3一抗，再加相應的二抗，DAB顯色后立即用水沖洗，照相，經(jīng)掃描后用美國UVP公司Lab Works 4.5軟件處理，確定相對吸光度值(每次對照的吸光度值為相對值1)。

1.5.3 免疫組化法檢測Bcl-2和Bax蛋白表達采用ABC法，DAB顯色。Bcl-2、Bax陽性表達呈棕黃色顆粒。每張切片隨機選取10個高倍視野，分別計數(shù)陽性表達心肌細胞數(shù)和心肌細胞總數(shù)并進行匯總，計算蛋白表達陽性心肌細胞數(shù)占心肌細胞總數(shù)的百分率。

1.6 HE染色觀察心肌組織學變化 于實驗結(jié)束后摘取心臟，冰生理鹽水沖凈血液，取左心室前壁部分組織，4%多聚甲醛固定，用70% ～100%的酒精梯度脫水，二甲苯中透明兩次，入石蠟內(nèi)進行包埋，將修好的石蠟塊固定于石蠟切片機上切片，厚度為4 μm，將完全展開的石蠟片貼附于清潔載玻片上，4℃ 保存?zhèn)溆?，常?guī)HE染色。

2 結(jié)果

2.1 心肌缺血后細胞凋亡率的變化 心肌缺血6 h后缺血組大鼠心肌組織細胞凋亡率明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01);NaHS 3個劑量組大鼠心肌組織細胞凋亡率明顯低于相應的缺血組(P＜0.05或P＜0.01，Tab 1，F(xiàn)ig 1)。

2.2 心肌缺血后細胞Bcl-2、Bax蛋白表達及Bcl-2/Bax比值的變化 免疫組化結(jié)果顯示，Bcl-2和Bax蛋白陽性表達呈棕黃色顆粒，主要在心肌細胞和內(nèi)皮細胞胞質(zhì)表達，假手術(shù)組大鼠心肌細胞可見少量的Bcl-2和Bax蛋白陽性細胞，缺血組大鼠心肌細胞可見少量的Bcl-2和大量Bax蛋白陽性細胞，與假手術(shù)組比較，缺血組大鼠心肌細胞Bax蛋白表達明顯升高(P＜0.01)，Bcl-2蛋白表達無明顯變化(P＞0.05)，Bcl-2/Bax比值明顯降低(P＜0.01)。與缺血組比較，缺血3 h時給予NaHS低、中、高劑量治療大鼠心肌組織Bcl-2蛋白表達明顯升高(P＜0.01)，Bax蛋白表達明顯降低(P＜0.01)，Bcl-2/Bax比值明顯升高(P ＜0.01，Tab 1，F(xiàn)ig 2，3)。

Tab 1 Effects of NaHS on the apoptosis rate and the expression of caspase-3，bcl-2 and Bax，and bcl-2/Bax in myocardium after ischemia in rats(±s，n=8)

Tab 1 Effects of NaHS on the apoptosis rate and the expression of caspase-3，bcl-2 and Bax，and bcl-2/Bax in myocardium after ischemia in rats(±s，n=8)

＊＊P ＜0.01 vs sham group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs ischemia group

Group Apoptotic/% caspase-3(RD)Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax Sham 12.11 ±2.31 1.00 ±0.00 12.80 ±1.62 15.69 ±1.73 0.82 ±0.05 Ischemia 21.37 ±2.13＊＊ 3.94 ±0.39＊＊ 9.43 ±1.47 29.11 ±2.28＊＊ 0.32 ±0.02＊＊ischemia+NaHS(L)18.37 ±1.64# 3.2 ±0.35# 17.65 ±1.96# 21.08 ±1.47## 0.84 ±0.04##ischemia+NaHS(M)15.12 ±1.25# 2.68 ±0.33# 18.87 ±1.13## 19.27 ±1.23## 0.98 ±0.06##ischemia+NaHS(H)13.14 ±1.33## 2.50 ±0.25## 21.24 ±2.02## 17.67 ±1.59## 1.20 ±0.52##

Fig 1 Change of the apoptosis rate(%)in myocardium after ischemia in rats

2.3 心肌組織的形態(tài)學變化 HE染色光鏡觀察結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌細胞排列整齊，著色均勻。缺血組大鼠部分區(qū)域心肌纖維橫紋不齊或消失，核偏移甚至裂解消失，有炎性因子滲出。NaHS低、中、高劑量治療組大鼠心肌缺血損傷程度明顯減輕(Fig 4)。

2.4 心肌缺血后caspase-3蛋白表達的變化Western blot檢測結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌細胞僅有少量的caspase-3的表達;缺血后各組caspase-3表達量均明顯增加，缺血3 h治療3 h時，NaHS低、中、高劑量組與缺血組比較，心肌細胞caspase-3表達明顯降低 (P ＜0.05，Tab 1，F(xiàn)ig 5)。

3 討論

細胞凋亡作為細胞主動死亡形式具有復雜的分子生物學機制，受許多因素的影響，細胞凋亡的發(fā)生主要受細胞內(nèi)凋亡調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控，細胞凋亡的發(fā)生是促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間平衡喪失的結(jié)果，Bcl-2家族在各類刺激信號引起的凋亡中起關(guān)鍵作用［4］，其中Bcl-2和Bax是與凋亡密切相關(guān)的基因，Bcl-2為凋亡抑制基因，是膜的整合蛋白，在線粒體參與的凋亡途徑中起調(diào)控作用，能控制線粒體中細胞色素C等凋亡因子的釋放，抑制細胞凋亡，而Bax則介導細胞凋亡。當Bcl-2過量時，形成Bcl-2同源二聚體，細胞受到保護。當Bax過量時，形成Bax同源二聚體，細胞則趨向凋亡，Bcl-2的抗凋亡作用是通過與Bax組成異源二聚體，從而阻止Bax介導凋亡的作用，因此，在凋亡刺激因子(如細胞色素C、凋亡誘導因子、核酸內(nèi)切酶G)等作用下，這兩種蛋白的比例決定了細胞是凋亡還是存活［5］。caspase家族是細胞凋亡的啟動者和執(zhí)行者，其中caspase-3是caspase級聯(lián)下游一種與細胞凋亡密切相關(guān)的蛋白酶［6］。正常情況下，胞質(zhì)中caspase-3以無活性的酶原形式存在，激活后可引起細胞凋亡，研究表明，心肌缺血/再灌注損傷的心肌中存在大量的凋亡細胞，認為心肌缺血可通過誘導氧化應激狀態(tài)和促進死亡受體及配體的表達激活caspase-3，引起心肌細胞凋亡［7－9］。Bcl-2可通過干擾細胞色素C的釋放而阻斷上游caspase-3蛋白酶的激活，抑制細胞凋亡。Bax蛋白作為線粒體膜上離子通道的組成成分，使細胞色素 C得以穿過線粒體膜，激活caspase-9，進一步激活 caspase-3，導致細胞凋亡［10－11］。

Fig 2 Change of the expression of Bax in myocardium after ischemia in rats

Fig 3 Change of the expression of Bcl-2 in myocardium after ischemia in rats

Fig 4 Pathological changes of myocardium by optical microscope after ischemia in rats(×400)

Fig 5 Change of the expression of Caspase-3 in myocardial tissue in rats

本實驗結(jié)果顯示，急性心肌缺血后，心肌損傷明顯，caspase-3蛋白表達明顯增加，Bcl-2蛋白表達降低，Bax蛋白表達則明顯升高，Bcl-2/Bax比值降低。假手術(shù)組大鼠心肌細胞可見較弱的caspase-3表達，可能是手術(shù)刺激所致。缺血后3 h經(jīng) H2S供體NaHS治療，心肌缺血損傷明顯減輕，心肌細胞caspase-3蛋白表達明顯降低，Bcl-2蛋白表達明顯升高，Bax蛋白表達明顯降低，Bcl-2/Bax比值明顯升高。因此，在心肌缺血后，H2S減輕心肌缺血損傷、抑制急性心肌缺血損傷引起細胞凋亡的機制可能與上調(diào)Bcl-2蛋白表達，下調(diào)Bax、caspase-3蛋白表達，升高Bcl-2/Bax比值有關(guān)，但是對其他細胞凋亡相關(guān)蛋白是否也有影響以及相關(guān)的作用機制，尚需進一步深入研究。

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