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      響應(yīng)面法優(yōu)化達(dá)托霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的研究

      2012-07-28 06:49:46宇光海尹艷麗
      化學(xué)與生物工程 2012年10期
      關(guān)鍵詞:爬坡菌體霉素

      宇光海,尹艷麗,張 垚

      (河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院生物工程系,河南 鄭州 450001)

      達(dá)托霉素(DAP)屬于A21978C家族,是一種含有13個(gè)氨基酸的大環(huán)脂肽類抗生素,在玫瑰孢鏈霉菌中以非核糖體蛋白合成酶(Non-ribosomal peptide synthetase,NRPS)機(jī)制合成,具有依賴于Ca2+破壞病菌細(xì)胞膜的新型作用,因此對(duì)許多耐藥病菌具有顯著的治療作用[1~4]。達(dá)托霉素具有在體外抗絕大多數(shù)臨床革蘭氏陽(yáng)性菌的作用,對(duì)于一些可選擇的抗生素很少的耐藥菌,如耐萬(wàn)古霉素的腸球菌(VRE)、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)、糖肽類敏感的金黃色葡萄球菌(GISA)、凝固酶陰性的葡萄球菌(CNS)和耐青霉素的肺炎鏈球菌(PRSP)等的感染具有有效的殺菌和抑菌效果[5]。達(dá)托霉素2003年被FDA批準(zhǔn)用來(lái)治療由革蘭氏陽(yáng)性菌引起的皮膚和皮膚結(jié)構(gòu)感染,2006年被FDA批準(zhǔn)用來(lái)治療由革蘭氏陽(yáng)性菌引起的菌血癥和由耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)引起的右側(cè)心內(nèi)膜炎[5]。因此,達(dá)托霉素已成為21世紀(jì)最具潛力和應(yīng)用價(jià)值的抗生素之一,其醫(yī)學(xué)價(jià)值、社會(huì)影響力與日俱增,市場(chǎng)前景廣闊。但仍存在產(chǎn)量低、成本高的問(wèn)題。因此,提高達(dá)托霉素的產(chǎn)量迫在眉睫。

      發(fā)酵培養(yǎng)基的組成對(duì)于目的產(chǎn)物的形成有著顯著的影響。對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,可以顯著提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量[6,7]。近年來(lái)培養(yǎng)基優(yōu)化方法已經(jīng)由傳統(tǒng)的耗時(shí)耗力的非統(tǒng)計(jì)優(yōu)化方法逐漸發(fā)展為統(tǒng)計(jì)優(yōu)化方法,其中最為常用的是Plackett-Burman 設(shè)計(jì)、最陡爬坡設(shè)計(jì)與響應(yīng)面設(shè)計(jì)相結(jié)合的優(yōu)化方法。Plackett-Burman 設(shè)計(jì)從多種因素中篩選出主要影響因子[8],最陡爬坡設(shè)計(jì)使主要因子的水平接近響應(yīng)面最大值,響應(yīng)面設(shè)計(jì)最后確定因素的最優(yōu)值[9]。該優(yōu)化方法已廣泛應(yīng)用于工程設(shè)計(jì)、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域,并取得了良好的效果[10]。

      作者在此采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)、最陡爬坡設(shè)計(jì)與響應(yīng)面設(shè)計(jì)相結(jié)合的優(yōu)化方法對(duì)達(dá)托霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,以提高達(dá)托霉素的產(chǎn)量。

      1 實(shí)驗(yàn)

      1.1 試劑與儀器

      達(dá)托霉素標(biāo)準(zhǔn)品,大連美倫生物技術(shù)有限公司;乙腈、甲醇為色譜純;其它試劑均為分析純。

      1200型高效液相色譜儀,美國(guó)Agilent公司。

      1.2 菌種與培養(yǎng)基

      玫瑰孢鏈霉菌(Streptomycesroseosporus)GC-68是StreptomycesroseosporusNRRL11379的自然篩選突變株,自行保藏。

      高氏一號(hào)培養(yǎng)基(斜面固體培養(yǎng)基,g·L-1):可溶性淀粉 20,KNO31,MgSO40.5,K2HPO40.5,NaCl 0.5,F(xiàn)eSO40.01,瓊脂粉 20,加蒸餾水定容至100 mL,pH值7.2~7.4。

      種子培養(yǎng)基(g·L-1):可溶性淀粉 20,KNO31,MgSO40.5,K2HPO40.5,NaCl 0.5,F(xiàn)eSO40.01,加蒸餾水定容至100 mL,pH值7.2~7.4。

      基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1):葡萄糖 7.5,糊精 10,可溶性淀粉 10,蛋白胨 8.5,酵母浸粉 6,干酪素 8.5,L-天冬氨酸 1,谷氨酸 0.5,MgSO40.5,K2SO40.5,K2HPO40.5,pH值7.2~7.4。

      1.3 方法

      將分離后的菌株接種于高氏一號(hào)培養(yǎng)基中,于30 ℃、濕度40%的條件下培養(yǎng)7 d;將斜面種子接種于已滅菌的種子培養(yǎng)基中,于30 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)48 h左右;取1 mL種子培養(yǎng)液接種于設(shè)計(jì)的發(fā)酵培養(yǎng)基中,于30 ℃、220 r·min-1搖床發(fā)酵7 d(48 h時(shí)加入0.2 g·L-1正癸酸),測(cè)定菌體生長(zhǎng)量和達(dá)托霉素產(chǎn)量,以確定最優(yōu)的培養(yǎng)基組成。

      1.4 分析與檢測(cè)

      菌體生長(zhǎng)量的測(cè)定采用干重法[11]。

      達(dá)托霉素產(chǎn)量的測(cè)定采用HPLC法[11]:分析柱為反相ODS柱,流動(dòng)相為含0.1%三氟乙酸的乙腈-水(45.5∶54.5,體積比),流速1 mL·min-1,柱溫30 ℃,柱壓8~9 MPa,檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。

      實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用Design expert 7.0軟件。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)

      根據(jù)單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示),并結(jié)合玫瑰孢鏈霉菌菌體生長(zhǎng)和發(fā)酵的特點(diǎn),選取11個(gè)因素(包括不同的碳源、氮源和微量元素),根據(jù)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基成分分別選擇一個(gè)高水平、一個(gè)低水平,進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),考察培養(yǎng)基中的11個(gè)因素對(duì)達(dá)托霉素產(chǎn)量的影響,結(jié)果見(jiàn)表1。

      表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果/g·L-1

      對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表2。

      由表2可知,除變量C、D、G的Prob>F值小于0.05外,其它變量的Prob>F值均大于0.05。說(shuō)明在Plackett-Burman設(shè)計(jì)中,變量C、D、G顯著,而其它變量不顯著[12]。表明變量C、D、G的模型貢獻(xiàn)率較大,是構(gòu)建模型的主要影響因素。運(yùn)用Design expert 7.0軟件對(duì)Plackett-Burman設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行回歸分析,得到關(guān)于響應(yīng)面的多元一次方程:DAP=233.17778+0.53333A-1.39167B-9.56000C-5.35333D-2.30000E+7.35556F-28.00000G,作為主要影響因素的變量C、D、G在多元一次方程中的系數(shù)都為負(fù)值,表明它們?cè)谀P椭械挠绊懢鶠樨?fù)效應(yīng),在后續(xù)的最陡爬坡設(shè)計(jì)中均需降低這些因素的實(shí)際濃度水平。

      2.2 最陡爬坡設(shè)計(jì)

      在Plackett-Burman設(shè)計(jì)得到的多元一次方程的基礎(chǔ)上,根據(jù)其系數(shù)的正負(fù)及大小,設(shè)計(jì)主要因素C、D、G的最陡爬坡實(shí)驗(yàn),選擇合適的上升路徑和步長(zhǎng),得出峰值,從而逼近其最大響應(yīng)區(qū)域,為下一步的響應(yīng)面設(shè)計(jì)做準(zhǔn)備[12]。其它次要因素均依照其在方程中系數(shù)的正負(fù)分別取Plackett-Burman設(shè)計(jì)編碼值的高水平或低水平。最陡爬坡設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

      由表3可知,3#實(shí)驗(yàn)的達(dá)托霉素產(chǎn)量最高,達(dá)176.85 mg·L-1。故以3#實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基配方作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)中心點(diǎn)。

      表2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方差分析

      表3 最陡爬坡設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

      以最陡爬坡設(shè)計(jì)得到的培養(yǎng)基配方為中心點(diǎn),運(yùn)用Design expert 7.0軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì),針對(duì)主要因素C、D、G的濃度使用中值組合重新編碼,以達(dá)托霉素的產(chǎn)量為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)[13],其因素與水平見(jiàn)表4。

      表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的因素與水平

      糊精、可溶性淀粉和L-天冬氨酸的濃度水平如表4所示,其它次要因素均取最低水平,進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表5。

      表5 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      使用Design expert 7.0軟件對(duì)表5數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表6。

      表6 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的回歸方程分析和方差分析

      R2=0.9636,R2(adj)=0.9267

      由表6可知,模型Prob>F值小于0.001,說(shuō)明模型極為顯著;變量A′、B′的Prob>F值小于0.001,極為顯著;變量C′顯著(Prob>F值小于0.05);交互項(xiàng)A′C′極為顯著(Prob>F值小于0.01);虛擬變量不顯著。說(shuō)明此模型選擇較為合理,分析結(jié)果較為可靠。回歸方程的決定系數(shù)R2=0.9636,說(shuō)明96.36%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可由回歸方程解釋,因此可用模型代替真實(shí)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?;貧w使用3-D Surface繪制響應(yīng)面三維曲線,如圖1所示。

      圖1 各因素交互作用響應(yīng)面圖

      由圖1可知,此響應(yīng)面的最高點(diǎn)在設(shè)計(jì)的模型范圍之內(nèi),說(shuō)明此響應(yīng)面的變量設(shè)計(jì)較好,可以進(jìn)行后續(xù)分析以求得響應(yīng)值最高點(diǎn)。

      對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸,得到響應(yīng)值擬合方程:DAP=180.20+0.037A′-1.63B′-1.76C′+5.03A′B′+1.05A′C′+2.98B′C′+2.20A′2-2.77B′2-0.45C′2,R2=0.9428。

      利用軟件的Numerical optimization 功能預(yù)測(cè)響應(yīng)值最大值,模型各因素的組合為糊精7.0 g·L-1、可溶性淀粉6.66 g·L-1、L-天冬氨酸0.4 g·L-1,達(dá)托霉素最大產(chǎn)量預(yù)測(cè)值為186.0 mg·L-1。

      2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

      為了驗(yàn)證Design expert 7.0軟件分析和預(yù)測(cè)結(jié)果的可信度,以預(yù)測(cè)響應(yīng)值的最大值所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基組成為配方進(jìn)行實(shí)驗(yàn),同時(shí)以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基作對(duì)照,結(jié)果見(jiàn)圖2。

      圖2 優(yōu)化前后菌體生長(zhǎng)及達(dá)托霉素產(chǎn)量

      由圖2可知,優(yōu)化前后,培養(yǎng)基中各組分含量的變化對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響不太顯著,但優(yōu)化后穩(wěn)定期菌體的干重明顯升高。穩(wěn)定期是達(dá)托霉素的主要合成時(shí)期,高的菌體濃度有利于達(dá)托霉素的合成,因此,由圖中曲線可以看到,培養(yǎng)基優(yōu)化后,達(dá)托霉素的產(chǎn)量顯著上升,由優(yōu)化前的106.7 mg·L-1最高可升到185.3 mg·L-1,提高了73.7%。這可能是由于,優(yōu)化后的培養(yǎng)基使達(dá)托霉素合成和菌體生長(zhǎng)有更好的平衡關(guān)系,使底物抑制作用降低,同時(shí)可以更好地為達(dá)托霉素的合成提供前體物質(zhì)。

      3 結(jié)論

      采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)、最陡爬坡設(shè)計(jì)與響應(yīng)面設(shè)計(jì)相結(jié)合的優(yōu)化方法,使用Design expert 7.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,得到了達(dá)托霉素的優(yōu)化培養(yǎng)基中糊精、可溶性淀粉、L-天冬氨酸的濃度分別為7.0 g·L-1、6.66 g·L-1、0.4 g·L-1,在此條件下,達(dá)托霉素的產(chǎn)量達(dá)到185.3 mg·L-1,比優(yōu)化前的106.7 mg·L-1提高了73.7%。

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