陳硯凝 張玉軍 呂 欣 劉青娟 劉淑霞 (河北醫(yī)科大學(xué)病理教研室，石家莊050017)

狼瘡腎炎(Lupus nephritis，LN)是典型的自身免疫復(fù)合物性腎炎，其繼發(fā)于自身免疫系統(tǒng)疾病-系統(tǒng)紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)，是SLE最重要的并發(fā)癥之一，也是患者死亡的主要原因［1，2］。至今LN的發(fā)病機(jī)制尚未明確。但是導(dǎo)致SLE發(fā)病的免疫細(xì)胞功能異常和細(xì)胞因子失衡可能是LN發(fā)病的核心。

γ干擾素(IFN-γ)作為可溶性細(xì)胞因子二聚體，從屬于Ⅱ型干擾素，主要由活化的T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(Natural killer，NK)產(chǎn)生，也可由已建立抗原特異性免疫的CD4和CD8陽(yáng)性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，是固有免疫和獲得性免疫的重要細(xì)胞因子。大量研究表明，IFN-γ的異常表達(dá)參與了SLE的發(fā)生和發(fā)展，是SLE發(fā)病過(guò)程中重要的細(xì)胞因子，在狼瘡性腎炎發(fā)病早期即出現(xiàn)明顯的表達(dá)升高［3］。我們前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，狼瘡性腎炎小鼠腎組織和血清中高遷移率族蛋白1(High mobility group box chromosomal protein 1，HMGB1)表達(dá)升高，并與腎臟損傷呈正相關(guān)性，同時(shí)IFN-γ可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的系膜細(xì)胞(Mesangial cell，MC)合成和分泌HMGB1［4，5］，但依賴(lài)于何種途徑，目前尚不明確。

因此本研究在以往實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)之上，以MMC為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)觀察IFN-γ是否影響JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1 的表達(dá)，并分析與HMGB1表達(dá)的關(guān)系，進(jìn)一步明確 IFN-γ介導(dǎo)HMGB1升高的可能機(jī)制，為闡明狼瘡性腎炎發(fā)病過(guò)程中HMGB1異常表達(dá)的分子機(jī)制、臨床選擇有效治療方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 小鼠系膜細(xì)胞MMC本實(shí)驗(yàn)室凍存。

1.1.2 培養(yǎng)基 DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.1.3 主要試劑 IFN-γ和 AG490(美國(guó) Sigma公司);鼠抗β-actin單克隆抗體(石家莊博海生物公司);兔抗 HMGB1多克隆抗體(Abcam);兔抗JAK1，p-JAK1多克隆抗體，鼠抗 JAK2，p-JAK2單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司);兔抗STAT1多克隆抗體，兔抗p-STAT1多隆抗體(Cell signal technology);辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG，辣根酶標(biāo)記羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)，PCR試劑盒(北京全式金生物技術(shù)公司);Trizol(USA Invitrigen)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將常規(guī)培養(yǎng)的MMC細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)24小時(shí)后隨機(jī)分成3組:對(duì)照組(N);IFN-γ(500 U/ml) 刺激組(IFN-γ);IFN-γ +AG490(IFN-γ 500 U/ml+AG490 200 μmol/ml)組(IFN-γ+AG490組，AG490預(yù)處理后45分鐘后加入 IFN-γ)，分別于 0、2、4、6、8、12 小時(shí)收集不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞。

1.2.2 Western blot 檢測(cè)系膜細(xì)胞中 JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1 的表達(dá) 收集不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞，低溫下提取細(xì)胞總蛋白和核蛋白(按照說(shuō)明書(shū)操作，購(gòu)自生工生物)并以紫外分光光度儀定量。等量蛋白(50μg或100μg)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉或BSA 37℃封閉2小時(shí)(磷酸化抗體用5%BSA封閉)，一抗4℃過(guò)夜，抗體及使用濃度如下:JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1 抗 體 濃 度 均 為 1∶500，HMGB1、β-actin抗體濃度均為1∶1 000。TBST 洗膜后以HPR標(biāo)記的IgG二抗(1∶5 000)37℃封閉2小時(shí)，TBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光成像。底片透掃后以LabWorks 4.5軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析，HMGB1蛋白表達(dá)以目的條帶和β-actin條帶積分光密度值的比值(IOD值)代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量;p-JAK1、p-JAK2和p-STAT1蛋白的表達(dá)量以p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1分別和 JAK1、JAK2和 STAT1的比值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量;STAT1核蛋白的表達(dá)量以STAT1條帶和Histone H3.1條帶積分光密度值的比值(IOD值)代表。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中HMGB1 mRNA表達(dá)

Trizol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)定量。取等量RNA，以M-MLV反轉(zhuǎn)錄為cDNA，TaqDNA聚合酶催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1。將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，然后進(jìn)入凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)進(jìn)行吸光度掃描，以管家基因β-actin作為內(nèi)參照校正，用目的基因的吸光度和β-actin吸光度的比值作為目的基因的相對(duì)表達(dá)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件處理，所有計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFN-γ能夠促進(jìn)小鼠系膜細(xì)胞JAK、STAT1磷酸化 經(jīng)條帶掃描，LabWorks5.0 分析，IFN-γ 刺激組(IFN-γ group)的細(xì)胞在 0、2、4、6、8、12 小時(shí)各時(shí)間點(diǎn)p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1的蛋白表達(dá)較正常培養(yǎng)組升高(圖1B、C)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);各時(shí)間點(diǎn)之間相比，非磷酸化JAK1、JAK2和STAT1蛋白表達(dá)未見(jiàn)明顯區(qū)別(圖1B)，但p-JAK1、p-JAK2和p-STAT1蛋白表達(dá)隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)增強(qiáng)，呈時(shí)間依賴(lài)性。在(IFN-γ+AG490)組0、2、4、6、8、12 小時(shí)時(shí) p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1 蛋白表達(dá)較IFN-γ刺激組(IFN-γgroup)明顯降低，并呈時(shí)間依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1D、E)。

表1 引物序列及PCR反應(yīng)條件Tab.1 Primer sequences and PCR reactive conditions

2.2 IFN-γ促進(jìn)系膜細(xì)胞STAT1蛋白核轉(zhuǎn)位 提取細(xì)胞的核蛋白，采用Western blot技術(shù)，以Histone H3.1為內(nèi)參照，結(jié)果顯示，IFN-γ能夠上調(diào)系膜細(xì)胞核內(nèi)STAT1蛋白的表達(dá)，并隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2A、B)。Western blot結(jié)果亦顯示，AG490預(yù)處理IFN-γ 刺激后(IFN-γ +AG490)在 0、2、4、6、8、12 小時(shí)STAT1核蛋白表達(dá)明顯低于IFN-γ單獨(dú)刺激組(IFN-γgroup)，并呈時(shí)間依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 IFN-γ能夠上調(diào)系膜細(xì)胞中HMGB1 mRNA及蛋白表達(dá) 與正常對(duì)照組相比，IFN-γ能夠上調(diào)系膜細(xì)胞中HMGB1mRNA及蛋白表達(dá)，并隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)，其相對(duì)表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，見(jiàn)圖3。

圖1 Western blot檢測(cè)p-JAK1、JAK1、p-JAK2、JAK2、p-STAT1、STAT1蛋白在不同組系膜細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)Fig.1 The expression of p-JAK1，JAK1，p-JAK2，JAK2，p-STAT1 and STAT1 protein in the MC cells by Western blot

圖2 Western blot檢測(cè)STAT1在不同組系膜細(xì)胞核蛋白內(nèi)的表達(dá)情況Fig.2 The expression of STAT1 nuleoprotein in the MC cells by Western blot

圖3 不同組系膜細(xì)胞HMGB1在mRNA和蛋白的表達(dá)Fig.3 The expression of HMGB1 mRNA and protein in the MC cells of different group by RT-PCR and Western blot

2.4 AG490能夠降低IFN-γ誘導(dǎo)的HMGB1 mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào) 為了明確JAK/STAT信號(hào)途徑是否參與IFN-γ誘導(dǎo)的HMGB1表達(dá)升高，我們采用用JAK特異性抑制劑AG490處理細(xì)胞，結(jié)果顯示:AG490處理后，IFN-γ刺激不能引起細(xì)胞內(nèi)JAK磷酸化，STAT1蛋白的核轉(zhuǎn)位顯著降低，同時(shí)系膜細(xì)胞中HMGB1 mRNA及蛋白表達(dá)較IFN-γ組降低，并隨時(shí)間延長(zhǎng)而下調(diào)，見(jiàn)圖3，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

狼瘡腎炎(LN)是危害系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)病人生命的重要并發(fā)癥之一。目前，雖然SLE詳細(xì)發(fā)病機(jī)制尚未明確，但公認(rèn)的免疫細(xì)胞功能異常和細(xì)胞因子失衡是SLE發(fā)病機(jī)制的核心。IFN-γ是SLE發(fā)病過(guò)程中重要的細(xì)胞因子，具有促進(jìn)發(fā)病，加重病情的雙重作用，并與腎臟損傷密切相關(guān)。IFN-γ從屬于Ⅱ型IFN，在先天性和獲得性宿主免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用;其能夠有效抑制細(xì)菌和病毒增殖，并調(diào)控細(xì)胞凋亡;同時(shí)IFN-γ還參與針對(duì)一些細(xì)胞內(nèi)病原體的宿主免疫反應(yīng)，雖然IFN-γ絕大多數(shù)在激活的T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞中產(chǎn)生，但是IFN-γ受體存在于大多數(shù)細(xì)胞中。IFN-γ對(duì)細(xì)胞的刺激可以引起STAT1蛋白聚集到IFNγRⅠ受體鏈的單個(gè)STAT1結(jié)合位點(diǎn)上，進(jìn)而可被JAK1/JAK2激活，之后STAT1從受體上游離、形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與GAS(gamma activated site)增強(qiáng)子家族結(jié)合參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)研究以小鼠腎臟系膜細(xì)胞(MC)為模型，以IFN-γ為刺激物，發(fā)現(xiàn)在刺激后出現(xiàn)JAK1、JAK2、STAT1的磷酸化和 STAT1的核輸入，同時(shí)伴有細(xì)胞中HMGBmRNA和蛋白表達(dá)升高，推斷 JAK/STAT1的活化參與了 IFN-γ介導(dǎo)的HMGB1 表達(dá)。Rendon-Mitchell等［7］在 RAW 264.7 cells發(fā)現(xiàn)STAT1可以誘導(dǎo)高遷移率族蛋白1(High mobility group protein box1，HMGB1)表達(dá)［8］。

為了進(jìn)一步證實(shí)在IFN-γ刺激的系膜細(xì)胞中JAK/STAT激活與HMGB1表達(dá)上調(diào)之間的確切關(guān)系，我們采用JAK特異性抑制劑AG490預(yù)處理細(xì)胞，旨在觀察抑制了JAK信號(hào)通路后是否降低IFN-γ誘導(dǎo)的HMGB表達(dá)，Western Blot結(jié)果顯示，采用AG490預(yù)處理后，IFN-γ刺激組 p-JAK1、p-JAK2和p-STAT1表達(dá)明顯下降，同時(shí)HMGB1mRNA及蛋白表達(dá)均下調(diào)，因此我們認(rèn)為IFN-γ可磷酸化Janus kinase(JAK)/signal transducer and activators of transcription(STAT)信號(hào)通路，并促進(jìn)STAT1入核，激活下游信號(hào)通路，誘導(dǎo)HMGB1表達(dá)，如圖4所示。

綜上所述，IFN-γ可以刺激體外培養(yǎng)的小鼠系膜細(xì)胞合成HMGB1，其機(jī)制可能與JAK/STAT信號(hào)途徑的活化有關(guān)。其合成后如何介導(dǎo)狼瘡性腎炎的發(fā)生，將有待于進(jìn)一步研究!

圖4 IFN-γ調(diào)控HMGB1表達(dá)的模式圖Fig.4 Ideograph of HMGB1 expression regulated by IFN-γ

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