張永翠 劉瑞風(fēng) 任國(guó)華 朱愛(ài)茹 王 榮 李新華 尹國(guó)華 張開(kāi)明

(菏澤市中醫(yī)醫(yī)院皮膚科，菏澤274000)

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者BMMSCs生物學(xué)活性有異常，并發(fā)現(xiàn)1例父母均為銀屑病的患者BMMSCs 在原代培養(yǎng)時(shí)即自發(fā)轉(zhuǎn) 化 為 VEC［1，2］。BMMSCs是骨髓中除造血干細(xì)胞以外的另一類多能干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能，已證實(shí)這類細(xì)胞在合適的體內(nèi)外特定條件下可向成骨、軟骨、神經(jīng)、肌肉、皮膚和VEC等多種類型的成熟細(xì)胞分化［3-5］。VEC在銀屑病發(fā)病中有重要作用，因此，我們?cè)O(shè)想銀屑病患者BMMSCs可能有易于向VEC分化的傾向，BMMSCs-VEC分化發(fā)育系統(tǒng)在銀屑病微血管異常中可能發(fā)揮重要作用。為此，我們將銀屑病患者和正常對(duì)照BMMSC體外定向分化為VEC，并對(duì)分化過(guò)程及分化的的VEC活性進(jìn)行初步研究，研究結(jié)果驗(yàn)證了開(kāi)始的設(shè)想，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下:

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 銀屑病組20例，均為本院皮膚科臨床及病理確診為銀屑病的門(mén)診患者，就診前2個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)使用過(guò)糖皮質(zhì)激素、維甲酸類藥物和免疫抑制劑。其中男12例，女8例;年齡20～45歲，平均30.56歲，病程7天～18年;皮損范圍占體表面積10% ～80%。對(duì)照組15例，取自本院血液科骨穿檢查正常的骨髓，性別、年齡與患者組匹配。取材均經(jīng)患者同意。

1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清(hyclone)、DMEM/F12培養(yǎng)基(hyclone)、人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)?、胰蛋白酶(Sigma)，F(xiàn)ITC-鼠抗人CD44、PE-鼠抗人 CD34、PE-鼠抗人 HLA-DR、FITC-鼠抗人CD45、FITC-鼠抗人CD29的單克隆抗體(BD公司)、鼠抗血管性假血友病因子(VonWillebrand Factor，VWF，Invitrogen)單克隆抗體、體外血管成形試劑盒(Millipore)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascularendothelial growth factor，VEGF，Sigma)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF，Sigma公司，美國(guó))、青鏈霉素緩和液(華北制藥廠)、倒置相差顯微鏡(Olympus公司，日本)、37℃恒溫培養(yǎng)箱(Shedon Manufactuing Inc)、流式細(xì)胞儀(BeckmanCoulter EPICS-XL型，美國(guó))。

1.3 BMMSCs的分離及培養(yǎng) 從髂后上棘，采取骨髓10 ml，用DMEM/F12培養(yǎng)液1∶1稀釋后加于淋巴細(xì)胞分離液上部，比例為2∶1，2 000 r/min，離心20分鐘，吸取中間的白膜層至新的試管中，以1 000 r/min離心10分鐘，棄去上清。重復(fù)洗滌細(xì)胞2次，然后加入含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100μg/ml、DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×106ml-1密度接種于24孔培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 BMMSCs體外培養(yǎng)擴(kuò)增 細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，全量換液(棄去未貼壁的細(xì)胞)，加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM/F12，繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，以后每3天半量換液1次，倒置顯微鏡下觀察生長(zhǎng)情況。貼壁的細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后即伸展，成梭形或多角形并開(kāi)始呈克隆性生長(zhǎng)，即為BMMSCs。生長(zhǎng)14天左右近80%融合時(shí)，吸凈培養(yǎng)液，而后每孔加入新鮮培養(yǎng)基洗脫未貼壁的細(xì)胞，然后每孔加入含0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA的消化液200μl消化3分鐘左右，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓部分脫落后，加入含血清的培養(yǎng)液終止消化，并輕輕吹打，以1 000 r/min離心8分鐘，去消化液，加10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸，接種于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，為第一代細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察生長(zhǎng)情況。按上述方法以1∶2繼續(xù)消化傳代培養(yǎng)，開(kāi)始誘導(dǎo)分化為VEC。

1.5 BMMSCs表面標(biāo)志鑒定 用FITC或PE標(biāo)記的表面分子 CD44、CD29、CD34、CD45、HLA-DR 抗體對(duì)第二代BMSCs進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)鑒定。

1.6 BMMSCs誘導(dǎo)VEC 在細(xì)胞傳至第三代再培養(yǎng)2天后對(duì)銀屑病組和正常對(duì)照組加入誘導(dǎo)劑(即bFGF 10 ng/ml、VEGF 50 ng/ml、2% 胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液)誘導(dǎo)BMMSCs向VEC分化，每3天半量換液，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，流式細(xì)胞術(shù)定期觀察細(xì)胞分化表達(dá)情況。

1.7 流式細(xì)胞儀測(cè) CD34、CD45、HLA-DR、ICAM-1表達(dá) 在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)VEC形態(tài)特點(diǎn)時(shí)，每個(gè)培養(yǎng)孔加入200μl 0.02%EDTA消化，用含胎牛血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)，吸管仔細(xì)吹打，離心后去上清，PBS洗滌1遍，用PBS制成懸液每份1×105個(gè)細(xì)胞調(diào)整到100μl，加入熒光標(biāo)記的抗體后冰上避光孵育30分鐘，以1 000 r/min離心8分鐘棄去PBS，再用PBS洗滌1次以去除未結(jié)合的熒光抗體，100μl Buffer重新懸浮細(xì)胞，在4℃下保存待測(cè)，用熒光標(biāo)記的表面分子CD34、CD45、HLADR、ICAM-1抗體對(duì)誘導(dǎo)的VEC進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)鑒定。

1.8 細(xì)胞免疫熒光法測(cè)定VEC內(nèi)VWF的表達(dá)情況 當(dāng)BMMSCs誘導(dǎo)21天，棄去培養(yǎng)液，PBS洗3遍，每次2分鐘，4%多聚甲醛固定30分鐘，PBS洗3遍，每次2分鐘，0.25%TritonX-100作用10分鐘，破膜處理，PBS洗3遍，每次2分鐘，1%羊血清常溫封閉30分鐘，棄去血清加入1∶200稀釋單克隆鼠抗人一抗，4℃過(guò)夜，然后棄一抗，PBS洗3遍，每次2分鐘，加入1∶50稀釋FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37℃孵育30分鐘，PBS洗3遍，每次2分鐘，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果:熒光閃亮，呈明顯的亮綠色判定為+++;熒光明亮，呈黃綠色判定為++;熒光較弱，但清楚可見(jiàn)判定為+;無(wú)熒光判定為-。

1.9 血管成形試驗(yàn)檢測(cè)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞體外血管成形能力［6］在96孔培養(yǎng)板中每孔加入50μl的凝膠基質(zhì)溶液，37℃孵育1小時(shí)，然后胰酶消化細(xì)胞，5×103細(xì)胞懸浮于50μl的DMEM/F12培養(yǎng)基中，觀察3個(gè)視野形成的血管數(shù)目的平均數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 BMMSCs培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察及表面標(biāo)志的鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)觀察 結(jié)果顯示:倒置顯微鏡下，銀屑病組與正常對(duì)照組BMMSCs形態(tài)上無(wú)差異。BMMSCs接種3天首次換液可見(jiàn)少量梭形或多角形貼壁細(xì)胞;10～20天左右細(xì)胞匯合可達(dá)80% ～90%，匯合細(xì)胞形態(tài)均一，成梭形排列。

2.1.2 表面標(biāo)志的鑒定 兩組細(xì)胞傳至第3代經(jīng)流式檢測(cè)，CD44(92.89%)、CD29(95.02%)均為陽(yáng)性，而HLA-DR(3.79%)及造血細(xì)胞表面標(biāo)志CD45(4.14%)、CD34(4.73%)陰性表達(dá)。圖 1 結(jié)果表明，所培養(yǎng)的細(xì)胞為較純的BMMSCs。

2.2 BMMSCs細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后形態(tài)學(xué)觀察及表面標(biāo)志的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 銀屑病組誘導(dǎo)后平均16.65天前倒置顯微鏡形態(tài):細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)BMMSCs形態(tài)的特點(diǎn);而后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)呈梭形，少部分區(qū)域呈集落生長(zhǎng);有的細(xì)胞形成血管腔樣結(jié)構(gòu)，管腔樣結(jié)構(gòu)周圍有呈鋪路石樣排列的內(nèi)皮樣細(xì)胞(圖2)。正常對(duì)照細(xì)胞組光鏡下觀察形態(tài)改變較晚且誘導(dǎo)21天形態(tài)沒(méi)有變化，而且不像銀屑病那么典型。

2.2.2 表面標(biāo)志的鑒定 銀屑病組和正常對(duì)照組誘導(dǎo)21天流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD45、HLA-DR、ICAM-1呈陽(yáng)性表達(dá)，與正常對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05，表1，圖3)。

圖1 BMMSCs的鑒定Fig.1 Phenotypic identification of BMMSCs

圖2 患者組與對(duì)照組誘導(dǎo)21天后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×100)Fig.2 Morphological features of the induced BMMSC from psoriatic patients and control group under microscope(×100)

表1 銀屑病患者組與對(duì)照組誘導(dǎo)的VEC表面抗原的表達(dá)(x ± s，%)Tab.1 Surface antigen expression of induced VEC between psoriasis patients and control groups( ± s，%)

表1 銀屑病患者組與對(duì)照組誘導(dǎo)的VEC表面抗原的表達(dá)(x ± s，%)Tab.1 Surface antigen expression of induced VEC between psoriasis patients and control groups( ± s，%)

Groups n CD34 CD45 HLA-DR ICAM-1 Psoriasis group 20 57.55 ±16.76 52.07 ±18.72 43.17 ±17.39 59.29 ±19.5 Control group 15 16.9 ±7.73 17.62 ±8.78 7.27 ±4.17 14.46 ±5.87 t 8.702 6.590 7.796 8.737 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組誘導(dǎo)21天內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志 HLA-DR、CD34、CD45 、ICAM-1表達(dá)比較圖Fig.3 The expression of endothelial-specific markers HLA-DR，CD34，CD45 and ICAM-1 was assayed by flow cytometry

表2 銀屑病患者組與對(duì)照組誘導(dǎo)的VEC內(nèi)的VWF表達(dá)情況Tab.2 The expression of endothelial-specific markers VWF was assayed by immunofluorescence cytochemistry

2.3 誘導(dǎo)后細(xì)胞免疫熒光分析 銀屑病組與正常對(duì)照組BMMSCs誘導(dǎo)21天后，銀屑病組可見(jiàn)細(xì)胞胞漿中有 VWF細(xì)胞免疫熒光，而對(duì)照組熒光強(qiáng)度很微弱，且可見(jiàn)非特異性熒光(圖4)，與正常對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05，表2)。

圖4 患者組與對(duì)照組VWF細(xì)胞免疫熒光(×100)Fig.4 Fluorescent staining of BMMSCs from a psoriatic patient and control group under microscope(×100)

2.4 誘導(dǎo)后的細(xì)胞體外血管成形分析 銀屑病組與正常對(duì)照組BMMSCs誘導(dǎo)21天后，進(jìn)行體外血管成形實(shí)驗(yàn)，5小時(shí)后倒置顯微鏡下觀察:誘導(dǎo)的銀屑病組可見(jiàn)有大量毛細(xì)血管管腔樣結(jié)構(gòu)形成，5例銀屑病患者3個(gè)視野下平均形成的管腔數(shù)為65個(gè);而5例對(duì)照組平均形成的管腔數(shù)為(42±1)個(gè)，但培養(yǎng)基中還可見(jiàn)沒(méi)有形成管腔樣結(jié)構(gòu)的球形細(xì)胞存在，表明尚有部分細(xì)胞未形成血管樣結(jié)構(gòu)。

3 討論

新生血管形成是銀屑病皮損真皮中主要的病理變化之一，真皮乳頭層微血管異常增生可能啟動(dòng)了皮損部位病理變化過(guò)程。研究顯示，銀屑病皮損表皮分泌VEGF，并與真皮毛細(xì)血管增生擴(kuò)張密切相關(guān);VEGF及其受體在銀屑病新生血管形成中起重要作用［7］;另外，其它血管活性因子(如內(nèi)皮素、一氧化氮、降鈣素基因相關(guān)肽等)在銀屑病皮損中含量顯著增高，通過(guò)一系列作用影響和調(diào)節(jié)局部微血管的功能及皮膚炎癥［8］。然而，銀屑病明顯且復(fù)雜的遺傳背景提示固有的內(nèi)部因素可能在銀屑病局部微血管異常中發(fā)揮更為重要的作用。Prodanovich等［9］的近期研究表明，銀屑病患者比對(duì)照組更易患動(dòng)脈粥樣硬化，也更易患缺血性心臟病、腦血管疾病或外周血管疾病;另外，重癥銀屑病可伴有系統(tǒng)性血管通透性增高［10］，均提示銀屑病血管異?？赡苁且环N全身性、系統(tǒng)性反應(yīng)。

目前關(guān)于銀屑病VEC研究全部集中在VEC本身異常及其如何參與銀屑病發(fā)生，但關(guān)于VEC障礙又是何種因素所致，目前尚不太清楚。根據(jù)對(duì)T細(xì)胞研究結(jié)果［11，12］，推測(cè)造血干細(xì)胞異常參與了銀屑病發(fā)病。經(jīng)過(guò)初步研究我們首先發(fā)現(xiàn)銀屑病患者骨髓造血干細(xì)胞定向分化的T細(xì)胞具有銀屑病T細(xì)胞活性，細(xì)胞因子產(chǎn)生及對(duì)表皮等作用與銀屑病外周血T細(xì)胞有很多相似的免疫特性［13-15］。由于骨髓造血微環(huán)境對(duì)造血干細(xì)胞分化有重要影響，且BMMSCs是造血微環(huán)境的重要組成部分，對(duì)造血細(xì)胞的增殖和分化起著重要的調(diào)控作用，我們前期對(duì)銀屑病患者BMMSCs進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)銀屑病患者BMMSCs生物學(xué)活性有異常［1］，并發(fā)現(xiàn)1例父母均為銀屑病的患者BMMSCs在原代培養(yǎng)時(shí)即自發(fā)轉(zhuǎn)化為VEC［2］。故我們?cè)O(shè)想BMMSCs-VEC分化發(fā)育系統(tǒng)異常，實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了開(kāi)始的設(shè)想，研究分析如下:

CD34是一種分子質(zhì)量為120 ku的單鏈跨膜蛋白，表達(dá)于早期淋巴造血干、祖細(xì)胞、VEC、胚胎成纖維細(xì)胞和某些神經(jīng)組織細(xì)胞［16］;ICAM-1在血管新生過(guò)程中也有重要作用，腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病視網(wǎng)膜病變及損傷修復(fù)中是促進(jìn)血管新生的因子之一;HLA-DR主要存在于B淋巴細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞及VEC的細(xì)胞膜上，在較為原始的干細(xì)胞中表達(dá)較少［17］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示銀屑病組流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志 CD34、CD45、HLA-DR 、ICAM-1呈陽(yáng)性表達(dá)，與正常對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。血管性假血友病因子(VWF)主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿中，可以作為內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定標(biāo)志，免疫細(xì)胞熒光結(jié)果顯示銀屑病組VWF的表達(dá)量高于對(duì)照組。以上結(jié)果顯示銀屑病組BMMSCs具有易于分化為VEC的傾向。

BMMSCs是多潛能干細(xì)胞可以向多種成熟細(xì)胞分化，其分化方向取決于體外培養(yǎng)條件及培養(yǎng)時(shí)間。由于BMMSCs向VEC分化需要時(shí)間較長(zhǎng)，且體外血管成形實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞同期性要求較高，因此在該部分實(shí)驗(yàn)中我們僅對(duì)10例樣本進(jìn)行研究。體外血管成形試驗(yàn)顯示銀屑病組形成的管腔個(gè)數(shù)多于對(duì)照組，提示銀屑病患者分化的VEC血管成形能力明顯高于對(duì)照組，BMMSCs-VEC分化發(fā)育系統(tǒng)異?？赡苁菍?dǎo)致銀屑病患者皮損真皮乳頭層微血管異常增生的根源。

1 鄧 起，劉瑞風(fēng)，王 麗et al.銀屑病患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞白介素-8、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子分泌水平的實(shí)驗(yàn)研究［J］.臨床皮膚科雜志，2010;39(9):545-547.

2 劉瑞風(fēng)，馮海燕，張 靜et al.銀屑病患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外自發(fā)向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化［J］.臨床皮膚科雜志，2010;39(7):7-10.

3 Grove JE ，Bruscia E ，Krause D S et al.Plasticity of bone-derived stem cells［J］.Stem Cells，2004;22:487-500.

4 Jiang Y，Jahagirdar B N，Reinhardt R L et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow［J］ .Nature，2002;418:41-49.

5 Bonnet D.Biology of human bone marrow stem cells［J］ .Clin Exp Med，2003;3:140-149.

6 段華新，盧光琇，程臘梅.JLFA-1和VLA-4參與人高增殖潛能內(nèi)皮祖細(xì)胞與血管內(nèi)皮的黏附和跨內(nèi)皮遷移［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2008;16(3):671-675.

7 Elias PM，Arbiser J，Brown B E et al.Epidermal vascular endothelial growth factor production is required for permeability barrier homeostasis，dermal angiogenesis，and the development of epidermal hyperplasia:implications for the pathogenesis of Psoriasis［J］.Am J Pathol，2008;173:689-699.

8 張錫寶，羅 權(quán)，吳志華et al.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體在銀屑病發(fā)病中的作用及意義［J］.中華皮膚科雜志，2005;38(1):8-10.

9 Prodanovich S，Kirsner R S，Kravetz JD et al.Association of psoriasis with coronary artery，cerebrovascular，and peripheral vascular diseases and mortality［J］.Arch Dermatol，2009;145:700-703.

10 Creamer D，Allen M，Jaggar R et al.Mediation of Systemic vascular hyperpermeability in severe psoriasis by circulating vascular endothelial growth factor［J］.Arch Dermatol，2002;138:791-796.

11 Li X，F(xiàn)an X，Zhang K et al.Influence of psoriatic peripheral blood CD4+T and CD8+T lymphocytes on C-myc，Bcl-xL and Ki67 gene expression in keratinocytes［J］.Eur J Dermatol，2007;17:392-396.12 Ferran M，Giménez-Arnau A M，Bellosillo B et al.Effector function of CLA(+)T lymphocytes on autologous keratinocytes in psoriasis［J］.Actas Dermosifiliogr，2008;99(9):701-707.

13 尹國(guó)華，李新華，張開(kāi)明et al..銀屑病患者骨髓CD34+細(xì)胞體外定向分化的T細(xì)胞活性研究［J］.中華皮膚科雜志，2006;39(2):124-127.

14 李新華，張開(kāi)明，尹國(guó)華.胸腺基質(zhì)細(xì)胞支持下骨髓CD34+細(xì)胞向T細(xì)胞體外定向分化［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2008;24(8):786-789.

15 Zhang K M，Li X H，Yin GH et al.Functional characterization of T cells differentiated in vitro from bone marrow-derived CD34+cells of psoriatic patients with family history［J］.Experimental Dermatology，2010;19:128-135.

16 周 俊，朱 兵，杜海燕.流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)合檢測(cè)骨髓細(xì)胞CD271、CD133、CD34的表達(dá)與分析［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2009;19(1):133-136.

17 Le Blanc K，Tammik C ，Rosendahl K et al.HLA expression and immunologic properties of differentieted and undifferentiated mesenchymal stemcells［J］.Exp Hematol，2003;31(10):890-896.