黃玉鈿 譚云山 曾海英 (福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院病理科，福州350009)

微血管形成是腫瘤細(xì)胞獲取營(yíng)養(yǎng)、腫瘤賴以存活及發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的最基本條件。凋亡抑制蛋白Livin和抑癌基因PTEN的異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色［1，2］。本研究采用 Elivision免疫組化法檢測(cè)90例乳腺癌組織和30例乳腺纖維腺瘤組織中Livin和PTEN的表達(dá)，分析乳腺癌中兩者表達(dá)與CD34標(biāo)記的微血管密度(MVD)及其它臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系，探討Livin和PTEN表達(dá)對(duì)乳腺癌血管生成與侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其意義。

1 材料與方法

1.1 材料 2002年至2011年間復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院和福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院切除的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，石蠟包埋組織90例，患者均為女性，年齡30～80歲，并以30例乳腺纖維腺瘤組織作為對(duì)照組，所有病例均有完整臨床資料，術(shù)前均未接受過(guò)放化療或免疫治療。乳腺癌組織病理學(xué)分級(jí)采用Bloom-Richardson系統(tǒng)Nottingham改良方案［3］;患者臨床分期按照TNM分期法(UICC，2003版)。

1.2 主要試劑和方法 兔抗人多克隆抗體Livin和VEGF為武漢Boster生物公司產(chǎn)品(工作濃度分別為1∶200和1∶100);鼠抗人單克隆抗體PTEN為美國(guó)LabVision-NeoMarkers公司產(chǎn)品，為即用型試劑;鼠抗人單克隆抗體CD34為美國(guó)LabVision-NeoMarkers公司產(chǎn)品，為即用型試劑;Elivision免疫組化試劑盒購(gòu)自福州邁新生物公司。采用EliVision免疫組化檢測(cè)法，乳腺癌及纖維腺瘤石蠟包埋組織制成的組織芯片蠟塊經(jīng)切片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)，加3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，加一抗(Livin、PTEN、VEGF、CD34抗體)，室溫下孵育 60 分鐘，加聚合物增強(qiáng)劑(試劑A)，室溫下孵育20分鐘;加酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物(試劑B)，室溫下孵育30分鐘，再經(jīng)DAB顯色，蘇木精襯染，梯度酒精脫水干燥，中性樹(shù)脂封片。用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)用PBS代替一抗為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷 Livin、PTEN和VEGF免疫組化檢測(cè)結(jié)果的判定均采用半定量法:先將特異性定位于乳腺癌細(xì)胞漿的染色按著色深淺打分:0分為無(wú)色、1分為淡黃、2分為棕黃、3分為棕褐;再將陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比打分:0分為陰性、1分為≤10%、2分為11% ～50%、3分為≥51%，兩種得分乘積≥3分為陽(yáng)性表達(dá)。采用免疫組化檢測(cè) CD34，其標(biāo)記的MVD 按照 Weidner的標(biāo)準(zhǔn)［4］，CD34陽(yáng)性染色定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞，呈棕黃色，乳腺癌組織內(nèi)孤立的棕黃色血管內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，不管其是否形成管腔，均代表一條可計(jì)數(shù)的微血管，但管腔直徑大于8個(gè)紅細(xì)胞的較大血管排除在外;在低倍鏡下選取4個(gè)微血管數(shù)量最豐富的區(qū)域，然后在高倍鏡視野(HPF，×400)下計(jì)數(shù)微血管的數(shù)目，取其平均值作為 MVD(個(gè)/HPF)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析:Livin、PTEN和VEGF陽(yáng)性率的組間差異顯著性檢驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn);用±s代表組內(nèi)MVD的平均水平，組間差異的顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Livin、PTEN、VEGF 和 MVD 在乳腺良惡性腫瘤中的表達(dá)差異 Livin、PTEN和VEGF陽(yáng)性表達(dá)位于乳腺癌的細(xì)胞漿(見(jiàn)圖1～3)，三者表達(dá)陽(yáng)性率分別為 54.4%(49/90)、48.9%(44/90)、61.1%(55/90)，三者在乳腺纖維腺瘤中的表達(dá)陽(yáng)性率分別為16.7%(5/30)、90%(27/30)、13.3%(4/30)，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。CD34陽(yáng)性定位于乳腺癌間質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞漿(見(jiàn)圖4)，CD34標(biāo)記的乳腺癌 MVD為(30.81±11.29)個(gè)/HPF，高于良性對(duì)照組的(9.62 ±2.97)個(gè)/HPF，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 Livin表達(dá)與乳腺癌臨床病理學(xué)參數(shù)及MVD、VEGF的關(guān)系 乳腺癌中Livin陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤大小、臨床分期呈正相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在不同年齡、病理分級(jí)、有/無(wú)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分組中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。乳腺癌中Livin陽(yáng)性組的MVD為(33.51±10.12)個(gè)/HPF，高于 Livin 陰性組的(27.58 ±9.34)個(gè)/HPF，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且Livin陽(yáng)性表達(dá)與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

圖1 乳腺癌細(xì)胞漿Livin的陽(yáng)性表達(dá)，Elivision免疫組化檢測(cè)(×400)Fig.1 Positive expression of Livin in plasma of breast cancer cells，Elivision immunohistochemistry( ×400)

圖2 乳腺癌細(xì)胞漿PTEN的陽(yáng)性表達(dá)，Elivision免疫組化檢測(cè)(×400)Fig.2 Positive expression of PTEN in plasma of breast cancer cells，Elivision immunohistochemistry( ×400)

圖3 乳腺癌細(xì)胞漿VEGF的陽(yáng)性表達(dá)，Elivision免疫組化檢測(cè)(×400)Fig.3 Positive expression of VEGF in plasma of breast cancer cells，Elivision immunohistochemistry( ×400)

圖4 乳腺癌間質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞漿CD34的陽(yáng)性表達(dá)，Elivision免疫組化檢測(cè)(×200)Fig.4 Positive expression of CD34 in plasma of microvessel endothelial cells in breast cancer stroma，Elivision immunohistochemistry(×200)

表1 Livin和PTEN表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系Tab.1 Relationships between the Livin and PTEN expression and the clinicopathological parameters in patients with breast cancer

表2 乳腺癌中Livin和PTEN表達(dá)與MVD及VEGF表達(dá)的關(guān)系Tab.2 Relationships between the Livin and PTEN expression and the MVD and the VEGF expression in breast cancer tissues

2.3 PTEN表達(dá)與乳腺癌臨床病理學(xué)參數(shù)及MVD、VEGF的關(guān)系 PTEN陽(yáng)性表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期呈負(fù)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在不同年齡、腫瘤大小、病理分級(jí)分組中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。PTEN陽(yáng)性組的乳腺癌組織 MVD 為(28.35 ±10.38)個(gè)/HPF，低于PTEN 陰性組的(33.16±11.07)個(gè)/HPF，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，PTEN陽(yáng)性表達(dá)與VEGF表達(dá)無(wú)顯著相關(guān)(P ＞0.05)，見(jiàn)表2。

3 討論

Folkman于1971年首次提出，惡性腫瘤的無(wú)限制侵襲性生長(zhǎng)及其轉(zhuǎn)移依賴于血管生成，新生血管為腫瘤生長(zhǎng)提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)支持，并為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供通道［5］，關(guān)于腫瘤血管生成機(jī)制及抗血管生成的研究逐漸成為當(dāng)今腫瘤研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。CD34是一種分子量為110 kD的單鏈跨膜糖蛋白，是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記，CD34標(biāo)記的微血管密度(MVD)反映了腫瘤組織內(nèi)血管生成的程度，已在許多腫瘤中證實(shí)是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織MVD較良性對(duì)照組顯著升高，提示乳腺癌的發(fā)生具有明顯的血管生成依賴性。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種重要的血管生成正性調(diào)節(jié)因子，能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并促進(jìn)新生毛細(xì)血管網(wǎng)的建立，提高微小血管的通透性，使血漿大分子外滲沉積在血管外的基質(zhì)中，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)等［6］。本研究顯示，乳腺癌VEGF陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于乳腺纖維腺瘤，提示VEGF對(duì)微血管生成的直接促進(jìn)作用，是乳腺癌MVD高于乳腺良性病變組織的重要原因。

凋亡抑制蛋白Livin(又稱ML-IAP)是2000年發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成員，它包含有一個(gè)高度保守桿狀病毒IAP氨基酸重復(fù)序列(BIR)和一個(gè)指狀結(jié)構(gòu)域，可編碼Livin-α和Livin-β兩種剪切異構(gòu)體［7］。與 IAP家族其他成員相似，Livin通過(guò)BIR結(jié)構(gòu)域與caspases結(jié)合并直接抑制caspases的酶水解活性，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用，在人類胚胎組織及大多數(shù)惡性腫瘤中高表達(dá)，正常成人組織中低表達(dá)。本研究結(jié)果表明Livin在乳腺癌中的表達(dá)陽(yáng)性率較良性組顯著增高，且Livin陽(yáng)性率隨乳腺癌腫瘤大小和臨床分期的上升而增高，提示Livin具有促進(jìn)乳腺癌生長(zhǎng)侵襲的作用，Livin陽(yáng)性表達(dá)反映患者預(yù)后不良。本研究還通過(guò)檢測(cè)乳腺癌間質(zhì)MVD水平，分析Livin與乳腺癌血管生成的關(guān)系，結(jié)果顯示，Livin陽(yáng)性組的乳腺癌中MVD水平比Livin陰性組顯著提高，且Livin陽(yáng)性表達(dá)與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)，提示Livin具有促進(jìn)乳腺癌血管生成的作用，該作用與Livin對(duì)VEGF表達(dá)的上調(diào)密切相關(guān)，其機(jī)制可能是通過(guò)Livin激活TAK1/JNK1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑增加VEGF基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)有關(guān)，該途徑獨(dú)立于 caspases途徑［8］。

抑癌基因PTEN基因定位于人染色體10q23，編碼403個(gè)氨基酸，具有雙重特異性磷酸酶活性，其抑癌作用主要通過(guò)脂質(zhì)磷酸酶活性使細(xì)胞內(nèi)第二信使3，4-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)和 3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)去磷酸化，負(fù)調(diào)控PI3K/PKB/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)caspase-9及P27等蛋白活性，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑癌作用［9，10］。本研究結(jié)果表明乳腺癌中PTEN的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于良性對(duì)照組，且PTEN陽(yáng)性率與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期呈負(fù)相關(guān)，提示PTEN缺失表達(dá)在乳腺癌的發(fā)生過(guò)程中扮演重要角色，PTEN蛋白能有效抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果還顯示，PTEN陽(yáng)性的乳腺癌組織MVD水平顯著低于PTEN陰性組，但PTEN陽(yáng)性表達(dá)與 VEGF表達(dá)無(wú)顯著相關(guān)，提示PTEN表達(dá)對(duì)乳腺癌的血管生成具有抑制作用，PTEN可能是通過(guò)蛋白酪氨酸磷酸酶作用，使粘著斑激酶(FAK)去磷酸化，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)［11］。

抑制血管生成是目前乳腺癌臨床治療研究的熱點(diǎn)之一，尋求抗乳腺癌微血管生成的有效靶點(diǎn)具有重要意義。本研究顯示Livin和PTEN在乳腺癌的血管生成及發(fā)生發(fā)展過(guò)程中分別起促進(jìn)和抑制作用，臨床檢測(cè)兩個(gè)指標(biāo)有助于乳腺癌患者的預(yù)后判斷，對(duì)Livin和PTEN表達(dá)的調(diào)控有望在乳腺癌的靶向治療中發(fā)揮一定作用。

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