周 潔，王忠華

(1.浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018;2.浙江萬(wàn)里學(xué)院生物技術(shù)研究所，浙江 寧波 315100)

貝母(Fritillaria L.)屬于百合科(Liliaceae)多年生草本植物。中藥貝母為干燥鱗莖，《中華人民共和國(guó)藥典》(2005版)將其分為土貝母、川貝母、平貝母、伊貝母、浙貝母和湖北貝母6大類［1］。浙貝母根據(jù)分類學(xué)的不同又分為大貝、中貝、小貝，或者分為為狹葉貝母、寬葉貝母、多籽貝母。浙貝母是浙江重要道地中藥材“浙八味”之一，具有極高的藥用價(jià)值。中醫(yī)認(rèn)為其苦、寒，歸肺、心經(jīng)，具有清熱散結(jié)、化痰止咳功能。至20世紀(jì)90年代，經(jīng)過(guò)對(duì)其藥理作用的深入研究，認(rèn)為浙貝母具有鎮(zhèn)咳、祛痰、松弛氣管平滑肌、鎮(zhèn)痛抗炎、活血化瘀、溶石、抗?jié)?、止瀉、抗菌、抗腫瘤等作用［2］。浙貝母原產(chǎn)于浙江寧波象山，而目前，其栽培基地主要分布于鄞州、磐安、縉云等地區(qū)，年栽培面積達(dá)3.97萬(wàn)hm2?，F(xiàn)在，磐安地區(qū)已成為浙貝母主要產(chǎn)地，同時(shí)也是浙貝母良種選育與種苗輸出的重要基地，面積在300 hm2以上［3］。但實(shí)際調(diào)查發(fā)現(xiàn)，磐安地區(qū)的浙貝母存在種質(zhì)資源混雜的現(xiàn)象，這對(duì)浙貝母的育種產(chǎn)生不良的影響。本文針對(duì)磐安地區(qū)的浙貝母進(jìn)行品種及種內(nèi)遺傳多樣性研究，為新品種選育奠定基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間ISSR(inter-simple sequence repeat)是一種基于微衛(wèi)星系列的分子標(biāo)記技術(shù)，它結(jié)合了隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)和簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，與以往的分子標(biāo)記相比，能夠提供更多的基因組DNA信息。此方法現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于藥用植物種質(zhì)資源鑒定、進(jìn)化與親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性與居群遺傳結(jié)構(gòu)檢測(cè)、遺傳作圖、基因定位、分子標(biāo)記輔助育種等方面研究［3］。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本文的浙貝母材料采自浙江磐安新渥、浙江磐安雙峰、浙江磐安宅口村等種植基地。材料的來(lái)源及品種名稱分別為磐安狹葉貝母、南通小貝、磐安雙峰狹葉貝母、磐安新渥大貝、磐安新渥多籽貝、磐安宅口狹葉貝母、磐安新渥中貝、磐安新渥多籽貝、磐安新渥中貝、磐安新渥中貝、磐安新渥本地大貝和磐安新渥本地大貝，編號(hào)分別為1—10。

1.2 浙貝母基因組DNA提取

采用改良CTAB法進(jìn)行浙貝母基因組DNA的提取，具體操作如下:取新鮮葉片0.1 g，用液氮研磨成粉末，放入1.5 mL的 EP管中，加入800 μL預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，混勻后65℃水浴1 h，13 000 r·min－1離心 15 min，取上清液，加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)輕輕混勻，13 000 r·min－1離心15 min，重復(fù)此步驟1次;取上清，加入2/3體積的異丙醇，放入－20℃冰箱30 min 沉淀 DNA;13 000 r·min－1離心10 min，倒掉上清液，再加入200 μL 70%乙醇洗滌DNA 2～3次;將1.5 mL Ep管倒置于通風(fēng)柜里，使 DNA盡量干燥;加入 500 μL的 TE，溶解 DNA;置于4℃冰箱保存，備用。DNA質(zhì)量用0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)，DNA純度和濃度通過(guò)紫外吸收法測(cè)定。

1.3 ISSR-PCR擴(kuò)增

經(jīng)過(guò)比較和優(yōu)化，ISSR-PCR的反應(yīng)體系為:10 × PCR Buffer 2 μL，25 mmol MgCl22 μL，10 μmol 引 物 1 μL，dNTP 1.6 μL，ddH2O 12.5 μL，Tag 酶 0.4 μL 和模板 DNA 0.5 μL。

擴(kuò)增反應(yīng):94℃ 預(yù)變性5 min;94℃變性45 s，50 ～ 60℃ 退火 45 s，72℃ 延伸 90 s，35個(gè)循環(huán);72℃ 延伸10 min;4℃ 保存。

ISSR引物采用加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的序列(http://www.biotech.ubc.ca/serices/naps/primers/primers.pdf)，由上海生工合成。從30個(gè)引物中篩選出7個(gè)擴(kuò)增條帶較多、信號(hào)強(qiáng)、背景清晰的引物用于ISSR分析。

1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，以2 000 bp marker作為標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照，在120 V穩(wěn)定電壓條件下電泳1.5 h左右，再用EB染色15～20 min后，用凝膠成像儀拍照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

在瓊脂糖凝脂電泳圖譜上，電泳條帶按有或無(wú)記錄，電泳條帶清晰的賦值為1，否則賦值為0。用NTSYS-PC(version 2.10)軟件系統(tǒng)計(jì)算材料間遺傳相似系數(shù)(GS)。并通過(guò)非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析，建立親緣關(guān)系圖［4］。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

采用30個(gè)ISSR引物對(duì)隨機(jī)選擇的2份貝母材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從中篩選出7個(gè)穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富的引物對(duì)所有貝母材料進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果見表1。

表1 ISSR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性

從ISSR擴(kuò)增條帶統(tǒng)計(jì)結(jié)果來(lái)看，7個(gè)引物共得到483條擴(kuò)增帶，其相對(duì)分子質(zhì)量在200～2 000 bp，其中多態(tài)性帶315條，多態(tài)性條帶百分率為65.22%，不同引物擴(kuò)增出的清晰條帶數(shù)在5～10，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出的片段條數(shù)為7.9條，擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)范圍為3～9，每個(gè)引物的多態(tài)性百分率為50% ～100%，平均每個(gè)ISSR引物擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶的數(shù)目為6，其中引物815，895的擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。

圖1 引物UBC815、UBC895 ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 遺傳相似系數(shù)分析

本試驗(yàn)收集了不同產(chǎn)地、品種的浙貝母，分析這些不同產(chǎn)地、不同品種間的遺傳多樣性，遺傳相似系數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。

表2 浙貝母遺傳相似系數(shù)分析結(jié)果

表2結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有貝母材料間的GS平均值為0.639 9，變化范圍為0.433 3～0.933 3，其中南通小貝和磐安雙峰狹葉貝母的GS(0.933 3)值最大，這表明其遺傳相似性最高，遺傳分化很小。而南通小貝和磐安新渥大貝、磐安新渥本地種大貝間的GS(0.433 3)最小，同時(shí)磐安新渥本地大貝和磐安雙峰狹葉貝母、南通小貝、磐安新渥多籽貝間的GS(0.433 3)也是最小。由此表明，南通小貝和磐安新渥大貝之間，磐安新渥本地種大貝與南通小貝、磐安雙峰狹葉貝母、磐安新渥多籽貝之間的遺傳相似性最小，發(fā)生了較大的遺傳分化。

2.3 親緣關(guān)系聚類分析

根據(jù)ISSR標(biāo)記計(jì)算的遺傳相似系數(shù)矩陣，采用NTSYS 2.10軟件按UPGMA法構(gòu)建8份材料的親緣關(guān)系聚類分析結(jié)果(圖2)。

圖2 浙貝母親緣關(guān)系聚類結(jié)果

從圖2可看出，8份浙貝母種質(zhì)可以分為兩大類群:第1大類群包括磐安狹葉貝母、磐安新渥大貝和磐安本地種大貝，其中磐安新渥大貝和磐安新渥本地大貝聚為1類，這說(shuō)明磐安大貝的遺傳分化程度較小;第2大類群則包括南通小貝、磐安雙峰狹葉貝母、磐安新渥多籽貝、磐安宅口狹葉貝母和磐安新渥中貝。

3 小結(jié)和討論

試驗(yàn)表明，經(jīng)過(guò)挑選后的ISSR引物擴(kuò)增后，DNA多態(tài)性好，條帶清晰，且聚類結(jié)果可以將所有材料區(qū)分開。由此可見，ISSR標(biāo)記技術(shù)適合用于浙貝母種質(zhì)資源的鑒定與遺傳多樣性研究。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，不同浙貝母材料的遺傳多樣性平均值為0.639 9，變化范圍在0.433 3～0.933 3。這表明磐安的浙貝母種質(zhì)資源間存在較豐富的遺傳多樣性。根據(jù)實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，浙江磐安栽培的浙貝母都是群體內(nèi)將選留的鱗莖進(jìn)行種植，即營(yíng)養(yǎng)繁殖，這是導(dǎo)致栽培的浙貝母種群間遺傳分化的最大的原因。不同產(chǎn)地，相同的品種如狹葉貝母經(jīng)過(guò)不同地方的種植，遺傳相似性較小，如磐安狹葉貝母與磐安雙峰狹葉貝母GS僅為0.500 0，與磐安宅口村的狹葉貝母GS為0.616 7，這也許與長(zhǎng)期隔離發(fā)生的遺傳分化有關(guān)。磐安產(chǎn)浙貝母資源不僅在種間存在著遺傳差異，種內(nèi)也存在著遺傳多樣性。如磐安新渥多籽貝種內(nèi)GS為0.816 7，磐安新渥中貝種內(nèi)GS為0.783 3，而磐安新渥本地種大貝種內(nèi)的遺傳差異最大，GS值為0.500 0，這可能由于種質(zhì)資源混雜造成的。因此，利用遺傳因素來(lái)區(qū)分種質(zhì)，尋找合適的育種資源，以減輕種質(zhì)資源混雜現(xiàn)象是必要的。另外，在浙貝母的生產(chǎn)過(guò)程中，控制不同品種栽培群體的傳播，也是避免混雜的一種途徑。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)中藥材種質(zhì)資源的鑒定從最初的形態(tài)學(xué)鑒定到細(xì)胞學(xué)標(biāo)記技術(shù)即核型分析和解剖學(xué)鑒定;然后是生化大分子標(biāo)記包括同功酶和蛋白質(zhì)指紋標(biāo)記;也有通過(guò)化學(xué)成分進(jìn)行種質(zhì)鑒定和分類［5］。但這些方法由于本身的限制不能直接地反映種質(zhì)的遺傳特性。近來(lái)發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記技術(shù)使得分子水平的鑒定成為可能，并得到了廣泛的應(yīng)用。2006年，李玉鋒等［6］采用 RAPD這種分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)8種貝母種進(jìn)行鑒定。2009年，陸含等［7］也采用 RAPD對(duì)浙貝母進(jìn)行鑒定。但由于RAPD的重現(xiàn)性較差，對(duì)種間和近緣屬間親緣關(guān)系研究有較大的局限性。目前，主要是運(yùn)用ISSR標(biāo)記法對(duì)浙貝母進(jìn)行鑒定。如2010年，劉曉賢等采用ISSR-PCR技術(shù)對(duì)浙貝母種質(zhì)進(jìn)行遺傳分析。另外，也有采用AFLP對(duì)浙貝母進(jìn)行種質(zhì)的遺傳多樣性分析，如2010年徐金中等［8］對(duì)浙江主產(chǎn)區(qū)栽培的浙貝母進(jìn)行的遺傳多樣性分析。現(xiàn)在，更為準(zhǔn)確的分子鑒定技術(shù)也漸漸發(fā)展起來(lái)，如對(duì)核糖體ITS序列，葉綠體基因組rbcL，trnL2F，matK序列的研究等。因此，針對(duì)浙貝母的種質(zhì)資源的鑒定、親緣關(guān)系研究等問題，在未來(lái)幾年內(nèi)可采用這些新興的分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行研究與育種應(yīng)用。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典(第一卷)［M］．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:205．

［2］張明發(fā)，沈雅琴．浙貝母藥理研究進(jìn)展［J］．上海醫(yī)藥，2007，10(28):459－461．

［3］王明明，宋振巧，王建華．ISSR標(biāo)記技術(shù)及其在藥用植物遺傳育種中的應(yīng)用［J］．中草藥，2007，38(1):134－137．

［4］黎開強(qiáng)，吳衛(wèi)，鄭有良，等．川產(chǎn)貝母種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析［J］．中國(guó)中藥雜志，2009，34(17):2149－2154．

［5］程遠(yuǎn)輝，張興翠．分子標(biāo)記技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用［J］．現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2006，20(2):58－60．

［6］李玉鋒，唐琳，陳放．8種貝母的 RAPD分析［J］．中成藥，2006，28(10):1528－1529．

［7］陸含，朱世華，周書軍，等．浙貝母4品種及5種貝母遺傳多樣性的 RAPD分析［J］．寧波大學(xué)學(xué)報(bào):理工版，2009，22(1):44－47．

［8］徐金中，張紅葉，馬喜彥，等．浙江主產(chǎn)區(qū)栽培浙貝母種質(zhì)遺傳多樣性的 AFLP分析［J］．中草藥，2010，41(1):109－113．