韋淑萍， 孫慧燕， 劉 未， 張文成△

(武警后勤學(xué)院 1人體解剖學(xué)教研室，2生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，天津 300162)

ZNF580是一個(gè)cDNA全長為1726 bp的新基因(GenBank注冊號:AF184939)，編碼172個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其C端94～172位氨基酸序列中含有3個(gè)串聯(lián)重復(fù)的C2H2型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域[1]。本組前期研究證實(shí)ZNF580在人多種組織中均有表達(dá)且融合有綠色熒光蛋白的ZNF580主要聚集于HEK293 和 MGC803 細(xì)胞的細(xì)胞核中[2－3]。C2H2型鋅指蛋白是人體最重要的一類調(diào)控蛋白，鋅指轉(zhuǎn)錄因子不僅與基因表達(dá)、細(xì)胞分化、配子形成、胚胎發(fā)育等生命現(xiàn)象密切相關(guān)，而且它的分子結(jié)構(gòu)變異與多種疾病及腫瘤相關(guān)[4]。GEO數(shù)據(jù)庫顯示:鋅指蛋白ZNF580在損傷的動脈組織及慢性肝炎、缺氧等疾病中表達(dá)均上調(diào)，提示ZNF580可能參與血管發(fā)生的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程。

血管發(fā)生是新生血管的形成方式，在腫瘤生長、組織修復(fù)、免疫反應(yīng)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、缺血性疾病、糖尿病性視網(wǎng)膜病等病理情況下起到重要作用[5]，而內(nèi)皮細(xì)胞的趨化、增殖、遷移、黏附和分化是生成新生血管的關(guān)鍵。多種細(xì)胞因子通過復(fù)雜的信號途徑調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而誘導(dǎo)血管的發(fā)生。血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅是覆蓋血管腔內(nèi)表面的第一道屏障，而且是研究血管發(fā)生的良好模型。

1－磷酸鞘氨醇(sphingosine 1－phosphate，S1P)是溶血磷脂家族的重要成員，越來越多的證據(jù)證實(shí)S1P參與了內(nèi)皮細(xì)胞遷移、分化、增殖、管道分化等血管發(fā)生的諸多過程[6－7]。S1P誘導(dǎo)的血管發(fā)生是通過與其特異性G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。S1P作用于不同的受體，進(jìn)一步通過 Gi、Gq、G12/13和 Rho 等途徑來激活效應(yīng)系統(tǒng)[8－9]，包括腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase，AC)、磷脂酶C(phospholipase C，PLC)、磷脂酶 D(phospholipase D，PLD)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)酶(extracellular signal－regulated kinase，ERKs)、c－Jun N 端激酶、p38絲裂原激活的蛋白激酶(p38 mitogen－actived protein kinase，p38 MAPK)和非受體酪氨酸激酶，將信息傳遞到細(xì)胞核，以調(diào)節(jié)靶基因的開關(guān)或表達(dá)水平，進(jìn)而發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。

然而，包含在S1P信號通路的核轉(zhuǎn)錄因子尚未報(bào)道，而且，ZNF580的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用還尚未被證實(shí)?；谝陨蟽牲c(diǎn)原因，本實(shí)驗(yàn)意在研究新鋅指蛋白ZNF580在S1P誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移中的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926、真核表達(dá)載體pEGFP－ZNF580和pEGFP－C1均為本室常規(guī)保存。

1.2 試劑 牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購自 TBD;高糖 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、MTT和DMSO購自Sigma;脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑與Trizol購自Invitrogen;RT－PCR試劑盒購自TaKaRa;PVDF膜購自Millipore;ZNF580多克隆抗體購自北京AVIVA生物工程有限公司;其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純;各引物序列均由北京賽百盛公司合成，見表1。

表1 引物序列Table1.Sequences of the primers

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926細(xì)胞用含10%BSA的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，3 d換液1次。取對數(shù)生長期細(xì)胞提取總RNA和蛋白。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期EA.hy926細(xì)胞，將其懸浮于不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，濃度約為5×109cells/L，接種到6孔板中2 mL/well，生長至90%～95%融合時(shí)分為 3組:正常組、pEGFPZNF580轉(zhuǎn)染組和pEGFP－C1空載體對照組。每組設(shè)6個(gè)平行孔。按LipofectamineTM2000產(chǎn)品說明書的操作方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。于37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h，收獲細(xì)胞提取RNA和蛋白。

2.3 RNA干擾 上海吉瑪公司化學(xué)合成3對RNA干擾序列(序列1～3)、1對陰性對照序列 (NC)和1對陽性對照序列(PC)，分別為:序列1上游引物5'－CUUCCAAAGGGAGGAGCAUTT －3'，下游引物 5'－AUGCUCCUCCCUUUGGAAGTT－3';序列2上游引物5'－CUUUCUAGCUGUGUGAUGUTT －3'，下游引物5'－ACAUCACACAGCUAGAAAGTT－3';序列3上游引物5'－GCACGUGCGCCUCCACUAATT－3'，下游引物5'－UUAGUGGAGGCGCACGUGCTG－3';NC上游引物5'－UUCUCCGAACGUGUCACGUTT－3'，下游引物 5'－ ACGUGACACGUUCGGAGAATT －3';PC上游引物5'－GUAUGACAACAGCCUCAAGTT－3'，下游引物 5'－CUUGAGGCUGUUGCAUACTT －3'。篩選出最佳干擾序列用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 RT－PCR 按Trizol試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA純度并定量(A260/A280值介于 1.80 ～2.00 之間)。用 1 μg 總RNA進(jìn)行cDNA的合成，半定量RT－PCR檢測目的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳并分析各目的基因與β－actin基因條帶吸光度值。

2.5 Western blotting 收集對數(shù)生長期細(xì)胞提取總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取各組樣品與5×SDS凝膠加樣緩沖液混合，煮沸變性5 min備用。取60 μg蛋白樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳(12%分離膠，5%積層膠，穩(wěn)壓160 V)。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后將膜置于裝有Ⅰ抗的雜交袋中，室溫孵育1～2 h后，4℃過夜。然后將膜置于裝有Ⅱ抗稀釋液的雜交袋中，室溫下孵育1～2 h后，采用HRP－DAB顯色，將膠片進(jìn)行掃描，凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的分子量和凈吸光度值。同樣步驟加入內(nèi)參β－actin抗體，檢測樣品中β－actin的蛋白表達(dá)作為內(nèi)參照。

2.6 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 37℃孵箱孵育預(yù)先加入matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室(聚碳酸酯膜孔徑8 μm)中過夜。無血清DMEM培養(yǎng)液饑餓細(xì)胞，次日消化并計(jì)數(shù)。向鋪膠的Transwell小室上室中加入200 μL/well密度為1×109cells/L的細(xì)胞，下室加入500 μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。37℃、5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞48 h，用棉簽擦掉上室殘余基質(zhì)膠和未穿過的細(xì)胞，下室固定染色，光鏡下觀察結(jié)果，計(jì)數(shù)細(xì)胞。每組設(shè)3個(gè)平行孔。

2.7 MTT比色法 0.25%胰酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，將濃度為1×107cells/L的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中200 μL/well，每組細(xì)胞設(shè)6個(gè)平行孔。無血清細(xì)胞培養(yǎng)液同步化細(xì)胞。37℃、5%CO2，含10%BSA的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h。每孔加入5 g/L MTT液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，酶標(biāo)儀測定各孔490 nm處的吸光度(A)值。細(xì)胞增殖率(%)=實(shí)驗(yàn)組平均A值/對照組平均A值×100%。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 S1P增強(qiáng)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞ZNF580的表達(dá)

利用 S1P1、S1P2、S1P3、S1P4 和 S1P5 各受體的上、下游引物，以提取EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞的總RNA作模板，經(jīng)RT－PCR擴(kuò)增cDNA的特異性片段，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測EA.hy926細(xì)胞S1P受體的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)S1P1、S1P3和S1P5受體，其cDNA的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物分別為352 bp、701 bp和236 bp，因此可作為研究S1P對EA.hy926細(xì)胞作用的良好模型，見圖1。

Figure1.S1P receptor expression profile in EA.hy926 cells.M:DL2000 marker;β－actin:547 bp;S1P1:352 bp;S1P3:701 bp;S1P5:236 bp.圖1 EA.hy926細(xì)胞表達(dá)S1P受體情況

1.1 劑量效應(yīng) EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞用不同濃度的S1P(0 μmol/L、0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L)刺激 4 h 后收集細(xì)胞(于加S1P前用無血清的DMEM培養(yǎng)液饑餓細(xì)胞12～16 h)，提取細(xì)胞總RNA和蛋白。結(jié)果顯示，S1P處理的EA.hy926細(xì)胞 ZNF580 mRNA(圖2A)和蛋白(圖2B)表達(dá)水平呈濃度依賴性增高。S1P濃度為0.5 μmol/L時(shí)，ZNF580的表達(dá)達(dá)到峰值。

1.2 時(shí)間效應(yīng) EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞用最適濃度S1P(0.5 μmol/L)孵育不同時(shí)間(0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h)后收集細(xì)胞(于加S1P前用無血清的HDMEM培養(yǎng)液饑餓細(xì)胞12～16 h)，提取細(xì)胞總RNA和蛋白。結(jié)果顯示，S1P處理的 EA.hy926細(xì)胞ZNF580 mRNA(圖3A)和蛋白(圖3B)表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性增高。S1P處理4 h，ZNF580的表達(dá)達(dá)到峰值。

Figure2.S1P upregulated both ZNF580 mRNA(A)and protein(B)levels in a concentration－dependent manner..n=6.*P＜0.05 vs control group.圖2 S1P上調(diào)ZNF580 mRNA和蛋白的表達(dá)具有濃度依賴性

Figure3.S1P up－regulated both ZNF580 mRNA(A)and protein(B)levels in a time－dependent manner..n=6.*P＜0.05 vs control group.圖3 S1P上調(diào)ZNF580 mRNA和蛋白的表達(dá)具有時(shí)間依賴性

2 S1P通過p38 MAPK信號通路影響ZNF580的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)分為正常對照組、S1P處理組、SB203580+S1P處理組和DMSO+S1P陰性對照組。當(dāng)細(xì)胞融合度為70%～80%時(shí)，在各組內(nèi)分別加10 μmol/L培養(yǎng)基、10 μmol/L 培養(yǎng)基、10 μmol/L SB203580 和 10 μmol/L DMSO;1 h 后，對應(yīng)組內(nèi)分別加 0.5 μmol/L培養(yǎng)基、0.5 μmol/L S1P(最適濃度)、0.5 μmol/L S1P 和0.5 μmol/L S1P;4 h(最適時(shí)間)后收集細(xì)胞(處理前用無血清的DMEM培養(yǎng)液饑餓細(xì)胞12～16 h)。收集的細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA和蛋白進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，SB203580顯著抑制了S1P對ZNF580表達(dá)的上調(diào)作用，見圖4。

3 ZNF580促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖

利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法獲得瞬時(shí)高表達(dá)和瞬時(shí)低表達(dá)ZNF580的內(nèi)皮細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為3組:EA.hy926正常組、pEGFP－ZNF580組和 ZNF580－siRNA組。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖 5A)顯示:pEGFPZNF580組遷移活性約為正常組的2.5倍，ZNF580－siRNA組遷移活性約為正常組的1/2(P＜0.01)。MTT增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖5B):pEGFP－ZNF580組增殖活性約為正常組的3倍，ZNF580－siRNA組增殖活性約為正常組的1/3(P＜0.01)。

Figure4.SB203580 partly inhibited S1P－induced up－regulation of ZNF580 mRNA(A)and protein(B)..n=6.*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs S1P group.圖4 SB203580抑制了S1P誘導(dǎo)的ZNF580表達(dá)的上調(diào)作用

Figure5.The effects of ZNF580 on endothelial cell migration(A，n=3)and proliferation(B，n=6)..＊＊P＜0.01 vs control group.圖5 ZNF580對內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖的影響

討 論

ZNF580是由本課題組克隆得到的一種新的鋅指蛋白基因。氨基酸序列分析顯示:ZNF580 N端5～88位氨基酸序列為脯氨酸富含域，C端94～172位氨基酸序列中含有3個(gè)串聯(lián)重復(fù)的C2H2型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域。多數(shù)C2H2型鋅指蛋白具有核定位信號(nuclear localization signal，NLS)，在真核細(xì)胞內(nèi)可穿過核孔進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，作為核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控其它基因的表達(dá)。本組前期研究工作:將ZNF580編碼區(qū)克隆到真核表達(dá)載體pEGFP－C1上，轉(zhuǎn)染人胚腎上皮細(xì)胞系HEK293和胃癌細(xì)胞系MGC803進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，融合有綠色熒光蛋白的ZNF580蛋白主要聚集于上述細(xì)胞的細(xì)胞核中。ZNF580蛋白的核定位信號位于C端C2H2型鋅指主構(gòu)域94～172位氨基酸區(qū)間。然而，ZNF580在內(nèi)皮細(xì)胞中遷移和增殖過程中的核轉(zhuǎn)錄作用至今尚不清楚。

S1P是溶血磷脂家族的一個(gè)重要成員，在細(xì)胞增殖、遷移、分化與凋亡及腫瘤形成等過程中發(fā)揮著非常重要的作用。S1P可與其特異性受體結(jié)合，通過多種信號通路(腺苷酸環(huán)化酶、磷脂酶C、c－Jun、p38 MAPK等)將信息傳遞到細(xì)胞核，激活核轉(zhuǎn)錄因子，從而發(fā)揮作用。我們的實(shí)驗(yàn)欲在S1P這個(gè)平臺上研究人C2H2型鋅指蛋白ZNF580這個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移中的作用。

本實(shí)驗(yàn)首先檢測了EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞S1P受體表達(dá)情況。結(jié)果顯示，EA.hy926細(xì)胞表達(dá)S1P1、S1P3和 S1P5三種S1P受體。故EA.hy926可作為研究ZNF580在S1P誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖作用的良好模型。

接下來檢測了 S1P刺激 EA.hy926細(xì)胞后ZNF580的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，S1P刺激EA.hy926細(xì)胞后，ZNF580 mRNA和蛋白的表達(dá)均增加，且有劑量(0～10 μmol/L)和時(shí)間(0～12 h)效應(yīng)。故推測ZNF580可能參與了S1P誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞后的生物學(xué)過程。有研究證實(shí)，S1P與其受體結(jié)合，通過激活重要的激酶，如p38 MAPK等信號通路影響內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖。我們檢測了p38 MAPK特異性信號通路抑制劑SB203580對ZNF580表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn) p38 MAPK特異性信號通路抑制劑SB203580能夠抑制S1P誘導(dǎo)的ZNF580的上調(diào)作用，說明S1P誘導(dǎo)的ZNF580表達(dá)通過p38 MAPK信號通路。MAPKs在細(xì)胞核發(fā)揮作用，其作用底物為核轉(zhuǎn)錄因子。而且，經(jīng)分子生物學(xué)網(wǎng)站分析:ZNF580蛋白14～17位 SSPE、93～96位SCPE和113～116位SHSD氨基酸為酪蛋白激酶II磷酸化作用位點(diǎn)(casein kinase II phosphorylation site);60～65位GVPYTY氨基酸為N－豆蔻酸化位點(diǎn)(N－myristoylation site);109～111位SHR和141～143位THR氨基酸為蛋白激酶C磷酸化作用位點(diǎn)(protein kinase C phosphorylation site);130～133位 KRSS氨基酸為cAMP及cGMP－依賴型蛋白激酶磷酸化作用位點(diǎn)(cAMP－and cGMP－dependent protein kinase phosphorylation site)。因此可以推測，核轉(zhuǎn)錄因子ZNF580可能為p38 MAPK的下游靶點(diǎn)。

轉(zhuǎn)錄因子與特異DNA序列結(jié)合，通過激活或抑制下游靶基因的表達(dá)從而產(chǎn)生廣泛的分子效應(yīng)。為了研究ZNF580在S1P誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖中的作用，我們利用pEGFP－ZNF580和ZNF580－siRNA分別轉(zhuǎn)染EA.hy926細(xì)胞，獲得瞬時(shí)過表達(dá)和瞬時(shí)低表達(dá) ZNF580的 EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞。ZNF580過(低)表達(dá)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖活性明顯增強(qiáng)(減弱)，提示ZNF580在S1P誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

綜上所述，S1P通過 p38 MAPK信號通路增強(qiáng)ZNF580的表達(dá)，ZNF580在S1P誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖的過程中起著非常重要的調(diào)控作用。該研究闡明了一條與血管發(fā)生相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，為探討ZNF580的功能及其與血管發(fā)生之間的關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)。

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