張華林，肖 遙，岑桂英，王曉民，郭愛(ài)珍，陳建國(guó)，付樹(shù)濱，李文功，楊利國(guó)＊

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院／動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.寧波第二激素廠，浙江 寧波 315300）

人絕經(jīng)期促性腺激素（HMG）是從絕經(jīng)期婦女尿液中提純得到、具有促卵泡素（FSH）和促黃體素（LH）活性的蛋白質(zhì)激素［1］，在醫(yī)學(xué)上廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)排卵和治療不育不孕癥。注射HMG可以增加卵巢中LH和FSH活性，防止卵巢過(guò)早黃素化，特異性調(diào)節(jié)卵泡生長(zhǎng)，臨床效果與重組FSH相同［2］。Lauria等［3］首次用HMG誘導(dǎo)牛超數(shù)排卵，并分析了超數(shù)排卵（簡(jiǎn)稱超排）后的內(nèi)分泌變化情況，結(jié)果表明：用HMG超排處理后的青年母牛臨床癥狀和內(nèi)分泌變化正常。他們進(jìn)一步比較HMG、FSH和PMSG用于牛超排的效果，發(fā)現(xiàn)HMG對(duì)刺激卵泡發(fā)育更有利［4］。我們前期的研究中采用分次肌肉注射激素方法對(duì)安格斯母牛進(jìn)行超排處理，發(fā)現(xiàn)HMG與FSH同樣安全有效，HMG和FSH超排處理后B超檢查牛只兩側(cè)卵巢上直徑大于1cm的卵泡數(shù)分別為10.33±0.52和9.25±0.46個(gè)（P＞0.05）［5］。

FSH和LH是由腺垂體分泌的兩種糖蛋白質(zhì)促性腺激素。在生理?xiàng)l件下，F(xiàn)SH刺激雌性動(dòng)物卵泡生長(zhǎng)和發(fā)育，LH協(xié)同F(xiàn)SH作用，刺激卵泡成熟和排卵［6］。因此在比較HMG和FSH一次性注射青年母牛的藥代動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，可以通過(guò)測(cè)定血清中FSH和LH水平來(lái)評(píng)估其生物學(xué)效價(jià)。在生產(chǎn)和臨床應(yīng)用中，F(xiàn)SH制品依據(jù)純度不同含有一定量的LH，商品制劑的純度不同，其藥物效價(jià)差異很大。中科院動(dòng)物所生產(chǎn)的FSH超排效果好，效價(jià)比較穩(wěn)定，已被國(guó)內(nèi)許多科研單位所接受［7］。在獸醫(yī)和動(dòng)物繁殖領(lǐng)域，HMG原料來(lái)源較FSH廣泛，生產(chǎn)成本較低，但是由于目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)沒(méi)有HMG獸藥產(chǎn)品，所以研究報(bào)道較少。本研究通過(guò)比較HMG和FSH一次性注射青年母牛的藥代動(dòng)力學(xué)差異和參數(shù)，為闡明HMG的作用機(jī)制、優(yōu)化使用方法、提高使用效果、確定適宜休藥期等提供依據(jù)，促進(jìn)該藥的推廣應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)牛只選擇

于2010年11月上旬，應(yīng)用超聲波診斷技術(shù)（B－型獸用超聲掃描儀，WED－9618V，深圳威爾德公司），在湖北省松滋市春珍肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)選擇健康的發(fā)情間期青年母黃牛20頭，隨機(jī)分成2組（HMG組和FSH組），稱重記錄，安裝頸靜脈血管屢。

1.2 激素處理，血樣采集及血清激素濃度測(cè)定

每頭牛按4IU／kg的劑量體重肌肉注射HMG（批號(hào)：090312，寧波第二激素廠）或4IU／kg的劑量FSH（10mg／瓶，含80IU FSH／mg，中科院動(dòng)物所2009年生產(chǎn)）。于激素注射前5min、注射后5min、10min、15min、20min、30min、45min、1h、1.5h、2 h、3h、4h、6h、8h、12h、15h、24h、36h、48h、72 h、96h、120h和144h（分別對(duì)應(yīng)采血次數(shù)編號(hào)1至23）各采集血樣5mL，置于碎冰中帶回實(shí)驗(yàn)室分離血清，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

血液中FSH和LH濃度采用放射免疫法測(cè)定，所用測(cè)定試劑盒購(gòu)自原子高科股份有限公司，具體操作步驟依據(jù)試劑盒中的說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

圖1 注射HMG后血液中FSH和LH水平變化

2.3 注射HMG或FSH后血液中FSH和LH的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

根據(jù)注射HMG或FSH后血液中FSH和LH變化曲線（圖1和2）計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是血藥峰濃度（Cmax）、達(dá)峰時(shí)間（tmax）、半壽期（t1／2），還是0至144h監(jiān)測(cè)期血藥濃度—時(shí)間曲線下面積（AUC0－144h），HMG均比FSH 強(qiáng)（表1）。

3 討論與小結(jié)

大量關(guān)于人的臨床實(shí)踐已證明HMG的有效性用Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理后用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)分析，計(jì)算平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，均數(shù)間采用F檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，對(duì)不同激素在血液中的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。測(cè)定結(jié)果以濃度－時(shí)間曲線表示，并分析計(jì)算得出藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 注射HMG后血液中FSH和LH水平變化

在注射HMG后血液中FSH和LH濃度呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，二者的變化趨勢(shì)基本一致，即在注射后6h（第13次采血）FSH和LH水平達(dá)到峰值（27.85±3.06mIU／mL和4.67±1.98mIU／mL，P＜0.05），血清中FSH濃度顯著高于LH濃度（圖1）。

2.2 注射FSH后血液中FSH和LH水平變化

圖2 注射FSH后血液中FSH和LH水平變化

在注射FSH后血液中FSH和LH激素含量也呈先升高后下降的趨勢(shì)，即在注射后0.5h（第6次采血），血液中FSH和LH激素水平達(dá)到峰值（4.65±0.29mIU／mL 和 1.44±1.44mIU／mL，P＜0.05），血清中FSH濃度顯著高于LH濃度（圖2）。與注射HMG相比，注射FSH后血液中FSH和LH升高的峰值較低。和安全性，研究發(fā)現(xiàn)人IVF周期單用HMG促排卵不僅能降低費(fèi)用，提高人IVF－ET每周期的性價(jià)比，而且可以獲得滿意的妊娠效果［8－10］。在畜牧生產(chǎn)上，胡偉等［11］比較了HMG和FSH用于山羊超排的效果，表明HMG優(yōu)于FSH；田秀娥等［12］比較了HMG和FSH用于綿羊超數(shù)排卵的效果，表明HMG可以代替FSH；我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)，采用分次肌肉注射激素方法對(duì)安格斯母牛超數(shù)排卵處理，HMG與FSH同樣安全有效［5］。HMG原料來(lái)源較FSH廣泛，因此成本較低，雖然在人不孕癥治療和畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，但是關(guān)于HMG在家畜上應(yīng)用的藥代動(dòng)力學(xué)研究卻鮮見(jiàn)，在一定程度上也阻礙了HMG的推廣和應(yīng)用。

母畜在排卵前，外周血中LH水平升高，出現(xiàn)排卵前分泌高峰，LH可以促進(jìn)卵泡液中蛋白分解酶的合成和釋放，限制成熟卵泡的血流量，引起卵泡破裂排卵。王居強(qiáng)等［13］報(bào)道，排卵前綿羊的LH峰值越高，胚胎發(fā)育越正常，綿羊的卵泡發(fā)育后期外周血中LH水平升高是啟動(dòng)卵母細(xì)胞成熟和排卵的重要條件。吳向豐等［14］研究也表明，在整個(gè)超排期間，綿羊血清中FSH濃度均高于相應(yīng)的對(duì)照組，其中二者峰值差異顯著。超排早期略高濃度的FSH可以促進(jìn)更多原始卵泡的募集，并且其峰值有支持有腔卵泡繼續(xù)發(fā)育和刺激顆粒細(xì)胞產(chǎn)生促卵泡受體（FSHr），從而促使顆粒細(xì)胞不斷發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)青年黃牛一次性注射HMG6h后血液中FSH和LH水平均達(dá)到峰值，而在注射FSH后血液中FSH和LH二者水平達(dá)到峰值時(shí)間僅為0.5h，并且HMG組血液中無(wú)論是FSH水平還是LH水平均顯著高于FSH組（圖1，圖2），這表明與FSH相比，HMG在用于家畜超數(shù)排卵時(shí)需要的激素量較少，而且在理論上超排效果也要優(yōu)于FSH。

表1 注射HMG和FSH后血液中FSH和LH的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

本研究中在對(duì)處于發(fā)情間期的青年母牛注射HMG或FSH后血液中FSH和LH水平都呈現(xiàn)先升高然后下降的趨勢(shì)，這符合一般藥物肌肉注射后的藥物代謝特征。注射HMG后血液中FSH和LH激素水平首先呈上升趨勢(shì)，藥代半衰期（t1／2）大約為18h；而注射FSH后血液中FSH和LH激素水平在注射后也呈上升趨勢(shì)，上升幅度均不大，藥代半衰期（t1／2）僅為6h（表1），這說(shuō)明 HMG肌肉注射后在體內(nèi)釋放和發(fā)揮藥效與FSH相比較緩慢，這與國(guó)外學(xué)者Lauria A等人研究結(jié)果一致，他們報(bào)道牛靜脈內(nèi)注射HMG后，其中的活性成分LH的半衰期為13.8～1 020min，活性成分FSH的半衰期為21.3～1 090min，不僅能促進(jìn)多個(gè)卵泡平穩(wěn)地發(fā)育并排卵，還能誘使牛機(jī)體排卵后卵巢類固醇激素的平穩(wěn)分泌，血漿中孕酮升高，對(duì)刺激牛只的卵泡發(fā)育更有利［3］。在單次注射HMG后，0至144h監(jiān)測(cè)期血液中FSH和LH血藥曲線下面積（AUC）為：971.21±342.06和176.28±81.80mIU＊hr／mL，均顯著高于單次注射FSH后同期內(nèi)血液中FSH和LH 血藥曲線下面積：39.81±18.01和32.00±20.92mIU＊hr／mL（表1），這說(shuō)明 HMG比FSH在體內(nèi)的代謝穩(wěn)定，其活性成分FSH和LH起作用的時(shí)間也較長(zhǎng)。家畜超數(shù)排卵是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，受很多因素的影響，不同品種的家畜對(duì)激素處理的反應(yīng)存在較大的差異，相同品種的不同個(gè)體對(duì)同種激素藥物處理的反應(yīng)也不一樣，動(dòng)物體內(nèi)主要激素水平及其變化也與超排效果有密切聯(lián)系［16］。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)家畜超數(shù)排卵處理常使用FSH，按遞減方法多次用藥，每次間隔12h肌肉或皮下注射一次，能夠取得較好的排卵效果；但是實(shí)際應(yīng)用繁瑣費(fèi)工，有時(shí)還發(fā)生浪費(fèi)藥品的情況等［15］。由本研究結(jié)果可知HMG比FSH在體內(nèi)的代謝穩(wěn)定，其活性成分FSH和LH起作用的時(shí)間也較長(zhǎng)，因此在家畜超數(shù)排卵時(shí)注射HMG后，其中的活性成分LH可以使供體母畜的發(fā)情時(shí)間提前，縮短試驗(yàn)周期，而且正是由于HMG的活性成分FSH和LH起作用的時(shí)間較長(zhǎng)，使用時(shí)只需肌注1次每天，相對(duì)于FSH要肌注2次每天的操作更加簡(jiǎn)便易行，比較適合進(jìn)行大規(guī)模數(shù)量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的超排工作。這在實(shí)驗(yàn)、生產(chǎn)過(guò)程中如果需要同等數(shù)量的胚胎時(shí)，使用HMG超排可減少供體母畜的用量，這樣我們既節(jié)約了供體母畜的投入，又節(jié)省了人力、時(shí)間，這在加速優(yōu)良品系家畜繁育的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用中具有較大的意義［11］。本研究中放射免疫法測(cè)定激素水平，靈敏度高，重復(fù)性好［6］，但是實(shí)驗(yàn)樣本量偏少，整體而言反映出了HMG和FSH一次性注射青年黃牛的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化特征，可以為該藥在超數(shù)排卵中的研究和應(yīng)用提供理論參考。

［1］ Filicori M，Cognigni G E.Clinical review 126：Roles and novel regimens of luteinizing hormone and follicle－stimulating hormone in ovulation induction［J］.J Clin Endocrinol Metab，2001，86（4）：1437－1441.

［2］ Filicori M，Cognigni G E，Pocognoli P，et al.Comparison of controlled ovarian stimulation with human menopausal gonadotropin or recombinant follicle－stimulating hormone［J］.Fertil Steril，2003，80（2）：390－397.

［3］ Lauria A，Genazzani A R，Oliva O，et al.Clinical and endocrinological investigations on superovulation induced in heifers by human menopausal gonadotrophin［J］.J Reprod Fertil，1982，66（1）：219－225.

［4］ Lauria A，Oliva O，Genazzani A R，et al.Improved method to induce superovulation in cattle using Human Menopausal Gonadotropin（HMG）［J］.Theriogenology，1982，18（3）：357－364.

［5］ 張華林，肖 遙，岑桂英，等.HMG和FSH用于安格斯牛超數(shù)排卵的效果比較［J］.中國(guó)奶牛，2012，217（1）：17－20.

［6］ 楊利國(guó)主編.動(dòng)物繁殖學(xué)（第二版）［J］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010，27－91.

［7］ 桑國(guó)俊.牛超數(shù)排卵技術(shù)研究［J］.中國(guó)動(dòng)物保健，2008，118（12）：108－109.

［8］ 鄧曉惠，張慧琴，于紅玲，等.IVF－E周期中 GnRH－a、FSH、HMG配伍方案的比較研究［J］.生殖與避孕，2002，22（1）：36－39.

［9］ 許 虹，全 松，邢福祺.添加人絕經(jīng)促性腺激素對(duì)IVF－ET術(shù)中卵巢反應(yīng)不良患者的意義［J］.中國(guó)婦幼保健，2009，24（20）：2819－2821.

［10］ 佟曉紅，文陶非，彭新良.HMG和r－FSH在IVF－ET周期中控制性超促排卵的臨床效果［J］.中國(guó)婦幼保健，2011，26（7）：1501－1502.

［11］ 胡 偉，陳美玨，黃 英，等.應(yīng)用HMG和FSH對(duì)山羊超排效果的分析［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2007，52（6）：30－31.

［12］ 田秀娥，王永軍，馬保華，等.HMG與FSH配合孕激素對(duì)多浪羊同期發(fā)情比較研究［J］.中國(guó)畜牧雜志，2010，46（19）：34－36.

［13］ 王居強(qiáng)，肖 杰，牛 暉，等.奶牛超數(shù)排卵期間血漿P4、E2和LH 水平變化［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，34（10）：93－96.

［14］ 吳向豐，桑潤(rùn)滋.小尾寒羊超數(shù)排卵期間血清FSH、LH、E2水平的變化研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006，49（10）：48－49.

［15］ 呂 津，桑潤(rùn)滋.牛羊超數(shù)排卵方法研究進(jìn)展［J］.黑龍江動(dòng)物繁殖，2005，13（1）：13－15.

［16］ 張俊功，譚秀文.季節(jié)和激素劑量對(duì)魯西黃牛超數(shù)排卵的影響［J］.中國(guó)牛業(yè)科學(xué)，2006，32（1）：32－37.