肖淦文，彭清潔，崔 朋，胡長敏，陳穎鈺，巴曉亮，陳煥春，郭愛珍＊

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070；3.武漢科前動(dòng)物生物制品有限公司，湖北 武漢 430070；4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，湖北 武漢 430070）

牛支原體（Mycoplasma bovis，M.bovis）是嚴(yán)重危害世界養(yǎng)牛業(yè)的重要病原之一，主要引起肺炎和乳腺炎，此外還可導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、角膜結(jié)膜炎、耳炎、生殖道炎、流產(chǎn)與不孕等多種病癥［1，2］。據(jù)報(bào)道，歐美國家約四分之一至三分之一的牛呼吸疾病綜合征是由牛支原體引起的［3］。同時(shí)，牛支原體與其它病原的混合感染和協(xié)同致病是牛支原體肺炎重要的致病機(jī)制之一［4，5］。據(jù)報(bào)道，混合感染的常見病原菌主要包括：多殺性巴氏桿菌（P.multocida）、化膿隱秘桿菌（A.pyogenes）、溶血性曼氏桿菌（M.haemolytica）、昏睡嗜血桿菌（H.somni）等［4］；混合感染的常見病毒有：牛副流感病毒3型（bovine parainfluenza－3virus，PI3V）、皰疹病毒Ⅰ型（bovine herpesvirus－1，BHV－1）、牛呼吸道合胞體病毒（bovine respiratory syncytial，BRSV）、牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）和牛冠狀病毒（bovine coronaviirus，BCV）等［5］。但是，不同國家和地區(qū)甚至農(nóng)場流行的菌株差異很大。自2008年以來，我國大部分省地區(qū)新從外地引進(jìn)肉牛爆發(fā)了以壞死性肺炎為主要特征的“傳染性牛支原體肺炎”疫情，多數(shù)牛在運(yùn)輸?shù)侥康牡睾?～2周左右發(fā)病，發(fā)病率為50%～100%，病死率高達(dá)10%～50%，給我國肉牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［6］。此外，奶牛也有暴發(fā)牛支原體肺炎的報(bào)道［7，8］。本文歸納整理了2008年以來本實(shí)驗(yàn)室對牛支原體肺炎的細(xì)菌學(xué)研究結(jié)果，以期進(jìn)一步闡明牛支原體肺炎的病原學(xué)特征，為臨床治療提供更多的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料收集

2008年6月至2011年11月，采用門診和出診的方式，收集我國肉牛養(yǎng)殖場疑似牛支原體肺炎的病牛病料，以場為單位，每場給1個(gè)編號(hào)。病料分布見表1。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定方法

無菌條件下采集患病牛鼻拭子、氣管拭子和病變肺組織，分別涂抹接種于含無支原體新生牛血清（杭州四季青有限公司）的TSA（Tryptic Soy Agar，胰蛋白胨大豆瓊脂）培養(yǎng)基平皿和PPLO（Pleuropneumonia－Like Organisms，類胸膜肺炎微生物）培養(yǎng)基平皿上。TSA平板于37℃培養(yǎng)8～16h，PPLO平板于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。

表1 病料時(shí)間和地區(qū)分布情況

獲得初始培養(yǎng)物后，用接種環(huán)挑取優(yōu)勢菌的單菌落轉(zhuǎn)接相同培養(yǎng)基，進(jìn)行純培養(yǎng)。進(jìn)一步通過革蘭氏染色鑒定、16SrDNA通用引物的PCR擴(kuò)增和測序鑒定、特異性PCR檢測等，確定混合感染菌種類。

PCR擴(kuò)增16SrDNA的通用引物及擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)［6］，引物序列如下：

P1：5＇AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG3＇

P2：5＇GGT TAC CTT GTT ACG ACT T3＇

在16SrDNA測序鑒定后，進(jìn)一步用牛支原體uvrC基因的特異性引物進(jìn)行牛支原體的鑒定［7］。

在16SrDNA測序鑒定后，進(jìn)一步根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法，用特異性PCR鑒定巴氏桿菌A和B型［8］。

在16SrDNA測序鑒定后，進(jìn)一步用化膿隱秘桿菌的16SrRNA基因的特異性區(qū)段設(shè)計(jì)引物進(jìn)行鑒定［12，13］。

所有引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，PCR擴(kuò)增所用試劑也購自該公司。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀和病理變化

所有病牛均具有相似的流行病學(xué)背景，牛只購進(jìn)不久就開始出現(xiàn)臨床癥狀，發(fā)病初期體溫升高至41～42℃，病牛精神沉郁，食欲減退，咳嗽、氣喘，早晚或氣溫轉(zhuǎn)涼時(shí)咳嗽加劇，有清亮或膿性鼻汁，嚴(yán)重者進(jìn)食停止；隨著病情發(fā)展患牛明顯消瘦，被毛粗亂，逐漸出現(xiàn)拉稀，甚至血便；有的患牛繼發(fā)關(guān)節(jié)炎，表現(xiàn)跛行、關(guān)節(jié)膿腫等癥狀；有的病牛繼發(fā)結(jié)膜炎，眼結(jié)膜潮紅，有大量漿液或膿性分泌物；后期肺部聽診呈濕啰音，嚴(yán)重病牛極度消瘦衰竭死亡，犢牛病情相對嚴(yán)重，病死率可達(dá)50%。

對來自全國不同地區(qū)的35個(gè)養(yǎng)殖場的123例病牛的臨床癥狀進(jìn)行歸納，結(jié)果發(fā)現(xiàn)85.71%的場以呼吸道癥狀為主，只有14.29%表現(xiàn)更為嚴(yán)重的腹瀉癥狀（表2）。

表2 疑似牛支原體肺炎病牛的臨床癥狀類似

2.2 大體病理變化

解剖病理變化主要表現(xiàn)在胸腔和肺部，其他臟器一般不表現(xiàn)病變，輕者肺臟可見尖葉、心葉及部分膈葉的局部紅色肉變，或同時(shí)有化膿灶散布；嚴(yán)重者肺臟質(zhì)地變硬并和胸膜發(fā)生不同程度粘連，表面有大小不等灰白或黃色干酪樣壞死灶（圖1左），或白色化膿灶（圖1右）；氣管、支氣管內(nèi)有干酪樣分泌物或乳白色泡沫，胸腔有少量積液，纖維蛋白滲出；心包積水，液體呈清亮黃色。

圖1 牛支原體肺炎病牛肺病變

2.3 細(xì)菌學(xué)檢測結(jié)果

對35個(gè)發(fā)病牛場的123例病牛的組織樣本進(jìn)行了細(xì)菌學(xué)檢測。各組織樣本中，以肺臟分菌率最高。牛支原體是分離率最高的致病菌，在各組織樣本中，以肺中牛支原體分離率最高，其次是喉拭子，鼻拭子分離率最低。

除牛支原體外，混合感染的細(xì)菌有9種。各病原菌的分離率為：牛支原體74%，多殺性巴氏桿菌17%，化膿隱秘桿菌14%，葡萄球菌9%，變形桿菌6%，溶血曼氏桿菌、化膿鏈球菌、奈瑟菌和地衣芽孢桿菌均為3%。所分離的多殺性巴氏桿菌全部為A型。發(fā)生關(guān)節(jié)炎的牛關(guān)節(jié)感染了化膿鏈球菌。此外，在肺中大腸桿菌分離率為19%，血清型待定（表3）。

在牛支原體分離陽性的26個(gè)牛場中，除大腸桿菌外，以牛支原體合并多殺性巴氏桿菌A型感染（混合感染4次）、牛支原體合并化膿隱秘桿菌感染為主（5次分離A.P均為混合感染），另有2個(gè)場只檢出多殺性巴氏桿菌A型而未檢出牛支原體。其它7個(gè)場未分到明顯的優(yōu)勢菌，分別為葡萄球菌、溶血曼氏桿菌、副流感3型病毒和病毒性腹瀉病毒感染。

表3 牛支原體肺炎病牛細(xì)菌學(xué)檢測結(jié)果

3 討論

從流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各個(gè)發(fā)病場情況類似，牛群在1～2周左右逐漸出現(xiàn)牛只體溫上升，食欲減退，呼吸系統(tǒng)癥狀是牛運(yùn)輸后發(fā)病的主要癥狀，首先為咳嗽、氣喘，隨后腹瀉、甚至血便，出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎，后期病牛極度衰竭或呼吸困難，導(dǎo)致死亡。因此，長途運(yùn)輸帶來的各種應(yīng)激因素?zé)o疑對疾病有促進(jìn)作用，這些應(yīng)激因素包括冷、熱、饑、渴、顛簸、疲勞、擁擠以及新場的陌生環(huán)境等。減少運(yùn)輸應(yīng)激能降低發(fā)病率［9］，但不能阻止發(fā)病。因此，特異性病原在牛運(yùn)輸后發(fā)病中起著決定性作用。

雖然，牛支原體是導(dǎo)致我國肉牛運(yùn)輸后發(fā)生肺炎的主要病原已成共識(shí)［1－6］，但臨床上混合感染現(xiàn)象時(shí)常發(fā)生。而混合感染常使疾病加劇，癥狀復(fù)雜化，甚至預(yù)后不良。各個(gè)國家或地區(qū)分離鑒定的混合感染病原差異較大［4，11］，本研究揭示多殺性巴氏桿菌A型和化膿隱秘桿菌是最常見的兩種混合感染細(xì)菌。

多殺性巴氏桿菌是?！按\(yùn)熱肺炎”病變肺中最常分離出的細(xì)菌，最常見的血清型為A∶3，正常情況下可共棲于牛的鼻咽部。單純感染較少見，常與溶血曼氏桿菌（M.haemolytica）和嗜昏睡桿菌（H.somni）、牛支原體和呼吸道病毒等混合感染。典型病變表現(xiàn)為支氣管肺炎，呈急性、亞急性或慢性纖維素性化膿性或纖維素性壞死性病變［10］。

化膿隱秘桿菌是致牛膿腫的常見病原菌，常在慢性支氣管肺炎部位發(fā)生嚴(yán)重的化膿性肺炎病變。犢?？蓮哪赣H獲得感染，通過入侵上皮細(xì)胞、在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活和形成生物膜等逃避免疫反應(yīng)［11］。

關(guān)于牛支原體分離率，本研究的分離率為74%與前期研究90%以上的分離率有差距［6］。牛支原體分離率偏低可能與樣本采集與分菌時(shí)取樣部位有關(guān)，據(jù)技術(shù)員發(fā)現(xiàn)，取肺病健交界部位進(jìn)行牛支原體分離的成功率最高；或者可能與樣本采集時(shí)間也有關(guān)，采集時(shí)間距牲畜死亡時(shí)間過長可能導(dǎo)致病原菌分離率降低。

基于牛支原體肺炎混合感染的復(fù)雜情形，臨床上對病料進(jìn)行細(xì)菌學(xué)分離與耐藥檢測，確定混合感染病原與敏感藥物，將對臨床治療具有重要意義。

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