周國慶 唐 琴 楊明峰 黃 麗 孫保亮

(山東省高校腦微循環(huán)重點實驗室，泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內科，山東泰安 271000)

CD4+CD25+調節(jié)性T細胞是一組具有免疫抑制功能的T細胞亞群，此亞群為某些組成性表達CD25(IL-2受體α鏈)的CD4+T細胞。其可以分為天然調節(jié)性T細胞(natural Treg，nTreg)和獲得性調節(jié)性T細胞(adaptive Treg，aTreg)，nTreg主要指胸腺髓質T細胞發(fā)育成熟后進入外周的Treg細胞，在預防病理性自身免疫反應中發(fā)揮作用;aTreg是由感染、移植、癌癥等抗原誘導CD4+T細胞轉化形成，在感染和移植免疫等發(fā)揮重要作用［1］。由于CD4+CD25+調節(jié)性T細胞約占正常人或大小鼠外周血CD4+T細胞的5% ～10%，由于其數(shù)量少，極大限制了其在多種疾病中的臨床應用。本實驗通過近年發(fā)展較快的免疫磁性分選技術，應用免疫磁珠兩步法分離純化大鼠脾臟和淋巴結CD4+CD25+調節(jié)性T細胞，并對其進行流式檢測和細胞活性檢測。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，由山東中醫(yī)藥大學動物中心提供，體重275～300 g。

1.2 實驗試劑和儀器

大鼠CD4+CD25+調節(jié)性T細胞提取試劑盒、MagCellect磁性分離儀購于 R＆D公司;Anti-rat CD4(APC)、Anti-rat CD25(PE)購于eBioscience公司;HANK＇S培養(yǎng)液購于Solarbio公司;FACS溶血素購于BD Biosciences公司;流式細胞儀購于美國BD公司;立式壓力蒸汽滅菌器購于上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠脾臟和淋巴結細胞懸液制備

將大鼠麻醉過量處死，無菌取脾臟和淋巴結(頭頸部，腋窩，腹股溝等部位)，放入已高壓消毒的無菌培養(yǎng)皿中，加入10 ml HANK＇S培養(yǎng)液;將其用磨砂玻璃片研磨，過100目濾網(wǎng)過濾轉至15ml的離心管中;1100 r/min離心5 min，去上清后加入5 ml FACS溶血素，混勻后靜置5 min;加入10 ml的PBS，1100 r/min離心8 min;去上清，加15 ml HANK＇S培養(yǎng)液離心洗滌一次，棄上清，用1×MagCellect Buffer將其懸浮，調整細胞懸液濃度至1×108/ml。

1.3.2 陰性選擇CD4+T細胞后陽性選擇CD4+CD25+T細胞

根據(jù)說明書進行磁性分選。首先陰性選擇CD4+T細胞，將2×108個細胞(2 ml)轉移到5 ml試管中，分別加入200 μl MagCellect CD4+T細胞抗體和250 μl MagCellect抗鼠IgG磁珠，依次輕輕混勻，分別在2～8℃孵育15 min;加入550 μl Buffer輕輕混勻，調整懸液體積至3 ml，將試管放于磁體中靜置10 min;當試管在磁體中時用無菌移液管將上清液吸出至于一新的5 ml試管中，放于磁體中靜置10 min;取出上清至15 ml離心管中，并計數(shù)。然后陽性選擇 CD4+CD25+T細胞，加入 Buffer至15 ml，1100 轉離心8 min;去上清，加100 μl Buffer混懸細胞，轉移到5ml試管中;每1×107個細胞分別加10 μl生物素標記的抗鼠 CD25抗體和10 μl Mag-Cellect抗生物素磁珠，依次在2～8℃冰箱中孵育15 min;加Buffer定容至1 ml，輕輕混勻，使溶液處于懸浮狀態(tài)，將試管放于磁體中靜置6 min，當試管在磁體中時，用消毒的移液管吸出上清液并去除;從磁體中取出試管，加1ml Buffer混懸細胞，重復一次后從磁體中取出試管，加1 ml Buffer混懸細胞，此為富含CD4+CD25+T細胞的細胞懸液，進行細胞計數(shù)。

1.3.3 CD4+CD25+T細胞純度和活性檢測

將CD4+T細胞和CD4+CD25+T細胞進行抗體標記(CD4-APC、CD25-PE)，流式細胞儀檢測細胞純度。用臺盼藍對CD4+CD25+T細胞進行染色，鏡下計數(shù)200個細胞計算細胞存活率，細胞存活率=(染色陰性細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%。

2 結果

分選前CD4+CD25+Tregs在正常大鼠脾臟和淋巴結單個核細胞中的比例為1.56%，第一步陰性選擇之后CD4+T細胞的純度為90.75%，第二步陽性選擇之后 CD4+CD25+Tregs的純度為86.70%，CD4+CD25+Tregs經(jīng)臺盼藍染色其活性97.00%。圖1為分選后流式細胞儀檢測結果。

圖1 免疫磁珠分選CD4+CD25+Tregs比例為86.70%

3 討論

調節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Tregs)最初被描述為CD4+CD25+的T細胞。新近的研究表明，Tregs由不同種類T細胞(主要包括CD4+T細胞、部分CD8+T細胞和自然殺傷T細胞)所組成。功能性或活化的Tregs表達一種關鍵的轉錄因子FoxP3，F(xiàn)oxP3是Tregs發(fā)生、維持及發(fā)揮功能所必須的。Tregs在抑制免疫系統(tǒng)激活中起關鍵性作用，因此而維持免疫穩(wěn)態(tài)、預防自身免疫反應及抑制各種因素所致的炎癥反應。Tregs功能破壞使免疫系統(tǒng)失調從而導致炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生。Tregs通過對效應T細胞和其它免疫細胞的負向調節(jié)而發(fā)揮免疫調節(jié)作用［2，3］。

CD4+CD25+調節(jié)性T細胞可以抑制性調節(jié)CD4+或CD8+T細胞活化與增值，在維持機體免疫耐受和免疫應答穩(wěn)態(tài)中起著非常重要的調節(jié)作用。該群細胞的另一個作用特點是能同時抑制初始T細胞和記憶性T細胞的增殖反應。Sakaguchi等［4］在1995年研究發(fā)現(xiàn)，將小鼠外周CD4+T細胞中的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞去除后能引起各種自身免疫性疾病，而將此類細胞輸注到裸鼠體內，可以預防因缺少這類T細胞亞群所導致的自身免疫性疾病。還可以抑制同種異體移植排斥反應，具有巨大的臨床治療應用潛能。從而引起研究者對CD4+CD25+調節(jié)性T細胞亞群的濃厚興趣。

Tregs具有免疫無反應性和免疫抑制性兩大特性。Tregs自身的免疫無反應性，表現(xiàn)在其對于IL-2以及共刺激分子的作用無反應，即使在TCR信號和IL-2的共同刺激下其增殖活化能力也很低;Tregs的免疫抑制性，則表現(xiàn)為抑制T細胞的增殖、分化，阻礙抗原提呈細胞(APC)的抗原提呈作用和直接介導靶細胞死亡，這些功能主要通過細胞-細胞接觸依賴機制或抑制性細胞因子依賴機制而發(fā)揮。Tregs的細胞-細胞接觸抑制機制尚未完全研究清楚，然而近年來的研究表明Tregs表達的細胞表面分子TGF-β、CTLA-4、GITR等在Tregs介導的細胞-細胞接觸抑制中發(fā)揮重要的作用。調節(jié)性T細胞可以直接殺死CD4+或CD8+T細胞通過穿孔素或粒酶依賴的機制。新近研究還發(fā)現(xiàn)，Tregs還可通過分泌可溶性細胞因子TGF-β、IL-10、IL-35等細胞因子方式抑制T細胞的活化和增殖，并且Tregs與T細胞的直接接觸可提升上述細胞因子對T細胞的抑制作用。Tregs免疫調節(jié)功能在體內的正常發(fā)揮，可抑制自身免疫細胞的活化，維持自身免疫耐受［5，6］。

磁性細胞分選(也稱免疫磁珠法)分離提取細胞的原理是:根據(jù)細胞表面抗原能和連接有磁珠的特異性單克隆抗體相結合，將其置于外加強磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在強磁場中，沒有此種表面抗原的細胞由于不能和連接著磁珠的特異性單克隆抗體結合而無磁性，在強磁場中不滯留，從而分離出目的細胞。具有快速、高效、對靶細胞的功能活性干擾小的優(yōu)點，并且不需要大型的儀器設備，還可以在試管中進行，容易進行無菌操作，對細胞的功能活性影響很小，提取分離后可以進行體外擴增培養(yǎng)，還可以直接進行流式細胞學的檢查。因此在對特定細胞亞群的功能研究中得到了廣泛的應用。CD4+CD25+調節(jié)性T細胞約占正常人或大小鼠外周血CD4+T細胞的5% ～10%［7］。本實驗我們采用免疫磁珠兩步法(陰性選擇和陽性選擇)提取分離大鼠脾臟和淋巴結CD4+CD25+調節(jié)性T細胞，先用陰性選擇提取CD4+T細胞，向試管內細胞懸液中加入非CD4抗體混合劑，得到富集的CD4+T細胞，再用抗CD25生物素化抗體和抗生蛋白鏈菌素磁珠陽性選擇CD4+CD25+調節(jié)性T細胞，并對提取的細胞進行流式檢測，最終獲得的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞純度在86.00% 以上，并且活性良好(活細胞百分率＞97%)。

最近，Liesz等人［8］的研究發(fā)現(xiàn)，Treg細胞是缺血性腦卒中后主要的抗免疫腦保護調節(jié)劑。Treg細胞通過抵消過量產生的促炎性細胞因子和調節(jié)淋巴細胞和小膠質細胞入侵和/或激活阻止繼發(fā)性梗死增長。Tregs發(fā)揮抑制免疫和炎癥反應作用的分子機制尚未完全闡明，但可能通過兩種主要模式即通過與被抑制的細胞的細胞間接觸，或者通過免疫抑制性細胞因子IL-10和TGF-β等而起作用。這些作用使T細胞在炎癥部位自我耐受，免疫穩(wěn)態(tài)，損害控制等領域成為關鍵因素［9，10］。

因此，通過提取高純度有巨大潛力的Treg細胞，拮抗促炎性細胞因子的產生和調節(jié)缺血腦組織中淋巴細胞和小膠質細胞活化，防止繼發(fā)性梗死的增長。這些結果為急性缺血性腦卒中免疫發(fā)病機制提供了的新見解，并有可能產生包括使用Treg細胞進行免疫調節(jié)治療的新方法。

［1］ Pacholczyk R，Kraj P，Lgnatowicz L.Peptide specificity of thymic selectin of CD4+CD25+T cells［J］.J Immunol，2002，168(2):613-620.

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［5］ Sakaguchi S.Regulatory T cells:key controllers of immunologic self-tolerance［J］.Cell，2000，101(5):455-458.

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［7］ 印永祥，韓曉楓，何陽.免疫磁珠兩步法分離小鼠脾臟 CD4+CD25+調節(jié)性T細胞［J］.標記免疫分析與臨床，2009，16(4):244-246.

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