姚瑤，周衛(wèi)，丁逸梅（1.南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，南京10009；.江蘇省藥物研究所，南京10009）

紫杉醇是從紅豆杉屬植物紅豆杉中提取的一種天然抗腫瘤藥物，臨床上主要用于卵巢癌、乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌的治療。紫杉醇的水溶性極低，目前臨床使用的紫杉醇制劑以聚氧乙烯蓖麻油（Cremphor EL）-無水乙醇（1∶1，V/V）為助溶劑。Cremophor EL會(huì)引起組胺釋放，產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)[1，2]，并且會(huì)誘導(dǎo)輸液用聚氯乙烯袋中的鄰苯二甲酸酯二-（2-乙基己基）（DEHP）泄漏[3～5]。因此，解決紫杉醇水溶性問題在該藥上市后引起了廣泛關(guān)注。

脂質(zhì)納米粒作為抗癌藥物載體可以提高藥物的治療指數(shù)，降低或減少藥物的不良反應(yīng)[6]。對(duì)于脂質(zhì)納米粒來說，體外釋放度是非常重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)，相應(yīng)的測(cè)定方法成為研究的重點(diǎn)。本研究制備了紫杉醇脂質(zhì)納米粒，并參考相關(guān)文獻(xiàn)，以固相萃取-高效液相色譜（SPE-HPLC）法對(duì)其體外釋放度進(jìn)行考察。

1 儀器與試藥

HPLC儀，包括2010 HT檢測(cè)器、LC-Solution色譜工作站（日本島津公司）；透析袋（截留分子量12 000～14 000，南京都英生物科技有限公司）；SEP-PAK?C18固相萃取柱（美國(guó)Waters公司）；BS 21S電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；ZRS-8G智能溶出儀（天津天大天發(fā)科技有限公司）。

紫杉醇原料藥（桂林暉昂生化藥業(yè)有限公司，批號(hào)：JF 20091001）；紫杉醇對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100382-200301）；注射用蛋黃磷脂（上海太偉藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1032482）；膽固醇（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；維生素E（德國(guó)Basf有限公司）；蔗糖（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水楊酸鈉（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、無水乙醇（色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫杉醇脂質(zhì)納米粒的制備

采用薄膜分散-高壓均質(zhì)法制備脂質(zhì)納米粒。稱取處方量的紫杉醇、注射用蛋黃磷脂、膽固醇和維生素E，溶解于適量無水乙醇后倒入茄形瓶，將茄形瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸干，除去乙醇成均勻薄膜；加入5%蔗糖水溶液水化一定時(shí)間后，90 000 kPa高壓循環(huán)4次得到均勻半透明乳液。0.22 μm微孔濾膜過濾后分裝到西林瓶?jī)?nèi)，冷凍干燥，即得樣品。

2.2 紫杉醇脂質(zhì)納米粒體外釋放度測(cè)定方法的建立

2.2.1 釋放介質(zhì) 水楊酸鈉可作為紫杉醇體外釋放的增溶質(zhì)[7，8]，本文采用水楊酸鈉（1 mol·L－1）-PBS（pH 7.4）作為釋放介質(zhì)。

2.2.2 色譜條件 色譜柱：Phenomenex luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（80∶20）；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：227 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取紫杉醇對(duì)照品約10 mg，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。精密吸取此貯備液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋，定容，搖勻，即得。

2.2.4 空白納米粒溶液的制備 按處方量稱取各輔料制備空白脂質(zhì)納米粒。取空白納米粒約100 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解稀釋至刻度，作為空白納米粒溶液。

2.2.5 供試品溶液的制備 精密移取體外釋放待處理樣品1 mL，加入經(jīng)活化過的C18固相萃取柱（用5 mL甲醇和5 mL水分別過柱2次），用10 mL蒸餾水沖洗，流速為0.2 mL·s－1，再以5 mL甲醇洗脫，速度為0.1 mL·s－1，收集甲醇濾過液，用氮?dú)獯蹈?，用流?dòng)相1 mL溶解，即得。

2.2.6 專屬性試驗(yàn) 取釋放介質(zhì)、對(duì)照品溶液和空白納米粒溶液，按“2.2.5”項(xiàng)下方法處理后，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。結(jié)果，在此色譜條件下，紫杉醇能與釋放介質(zhì)較好的分離，且峰形良好，保留時(shí)間適中，輔料和釋放介質(zhì)對(duì)主藥測(cè)定無干擾。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.紫杉醇對(duì)照品；B.釋放介質(zhì)；C.空白輔料Fig 1 HPLC chromatogramsA.paclitaxel control；B.release medium；C.blank sample

2.2.7 線性關(guān)系考察 取紫杉醇對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并定量稀釋成1.0 mg·mL－1的對(duì)照品溶液。分別精密量取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.8、1.0、1.2 mL，置10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。以紫杉醇的峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)，檢測(cè)濃度（c）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A＝2.165×104+4.248×104c（r＝0.999 3，n＝6）。結(jié)果表明，紫杉醇檢測(cè)濃度在2～12 μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。紫杉醇的定量限為0.05 μg·mL－1（S/N＝10）。

2.2.8 萃取回收率試驗(yàn) 分別精密量取0.2、1.0、1.2 mL紫杉醇對(duì)照品貯備液于10 mL量瓶，用釋放介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，得到低、中、高3種不同濃度的溶液，分別取1 mL，置于預(yù)先活化好的C18固相萃取柱上，按“2.2.5”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣20 μL，測(cè)定紫杉醇含量，計(jì)算萃取回收率。結(jié)果，紫杉醇低、中、高3種濃度的回收率分別為96.9%、97.2%、95.7%；RSD分別為1.33%、0.79%、1.46%（n均為3），表明本方法回收率良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別考察對(duì)照品溶液、樣品和供試品溶液的穩(wěn)定性 對(duì)照品溶液的穩(wěn)定性：精密量取1.0 mL紫杉醇對(duì)照品貯備液于10 mL量瓶中，用釋放介質(zhì)稀釋至刻度，得到10 μg·mL－1的溶液，置于37 ℃水浴保溫。分別于0、12、24 h，取1 mL溶液用預(yù)先活化好的C18固相萃取柱萃取，按“2.2.5”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，RSD＝0.35%（n＝3），表明紫杉醇對(duì)照品在37℃的釋放介質(zhì)中24 h內(nèi)穩(wěn)定。樣品的穩(wěn)定性：取樣品1瓶，加水5 mL，充分振搖，水化5 min后，得到納米粒混懸液（約2 mg·mL－1），精密吸取此混懸液0.1 mL，置10 mL量瓶中，以釋放介質(zhì)稀釋定容，37℃水浴保溫。分別于0、12、24 h，取1 mL納米?；鞈乙河妙A(yù)先活化好的C18固相萃取柱萃取，按“2.2.5”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，RSD＝0.21%（n＝3），表明樣品在37℃釋放介質(zhì)中24 h內(nèi)穩(wěn)定。供試品溶液的穩(wěn)定性：精密量取0.1 mL紫杉醇納米混懸液于10 mL量瓶中，用釋放介質(zhì)稀釋至刻度。取1 mL該溶液以預(yù)先活化好的C18固相萃取柱萃取，按“2.2.5”項(xiàng)下方法處理，所得供試品溶液置于自動(dòng)進(jìn)樣器中，分別于0、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，RSD＝0.29%（n＝3），表明供試品在萃取后24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 體外釋放度的考察

2.3.1 體外釋放的方法及釋放度測(cè)定 采用總體液平衡反向透析法，按照2010年版《中國(guó)藥典》（二部）項(xiàng)下方法[9]。以200 mL水楊酸鈉（1 mol·L－1）-PBS（pH 7.4）為釋放介質(zhì)，將裝有2 mL空白釋放介質(zhì)的大小形狀相同的透析袋，完全浸入釋放介質(zhì)中平衡2 h，精密吸取用蒸餾水復(fù)溶的紫杉醇脂質(zhì)納米?；鞈乙?.9 mL（相當(dāng)于紫杉醇約1.8 mg），直接加入到釋放介質(zhì)中，在100 r·min－1和（37±0.5）℃介質(zhì)溫度下進(jìn)行體外釋放試驗(yàn)。分別于0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、8.0、12.0、24.0 h從中取出一個(gè)透析袋，同時(shí)向透析袋外液中補(bǔ)充2 mL的空白釋放介質(zhì)，用SPE-HPLC法分別測(cè)定各個(gè)取樣點(diǎn)透析袋內(nèi)液中的藥物濃度；另取脂質(zhì)納米?；鞈乙?.1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻后以HPLC法直接測(cè)定總藥量。平行操作3份樣品，計(jì)算累積釋放百分率（Q）。同法測(cè)定紫杉醇原料藥的體外釋放度，計(jì)算24 h內(nèi)的Q值，以Q對(duì)時(shí)間（t）作圖，得到體外釋放曲線，詳見圖2。

由圖2可知，紫杉醇原料藥4 h釋放即達(dá)到98.84%，表明透析袋對(duì)紫杉醇無吸附；而載藥的脂質(zhì)納米粒在0.5 h之內(nèi)有突釋現(xiàn)象，釋放量為30.85%，這可能是未被包封的游離藥物和以弱的結(jié)合力吸附在納米粒表面的藥物的快速解吸附；在隨后的9.5 h內(nèi)，紫杉醇的釋放量隨著釋放時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；12 h后釋放達(dá)到平臺(tái)期，釋放量隨時(shí)間的變化不明顯；24 h累積釋放104.9%。

2.3.2 釋放曲線的擬合 根據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》（二部）項(xiàng)下方法[9]，分別用零級(jí)動(dòng)力學(xué)、一級(jí)動(dòng)力學(xué)、Higuchi方程對(duì)脂質(zhì)納米粒的體外釋放數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到納米粒體外釋藥的動(dòng)力學(xué)方程。結(jié)果，紫杉醇脂質(zhì)納米粒的體外釋放符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。紫杉醇脂質(zhì)納米粒體外釋放擬合方程見表1。

圖2 紫杉醇脂質(zhì)納米粒體外釋放曲線（n＝3）Fig 2 In vitro release profile of Paclitaxel lipid nanoparticles（n＝3）

表1 紫杉醇脂質(zhì)納米粒體外釋放擬合方程Tab 1 Fitted drug release kinetic equation of Paclitaxel lipid nanoparticles in vitro

3 討論

固相萃取柱是利用固體吸附劑將樣品中的目標(biāo)化合物吸附，使目標(biāo)化合物與干擾物分離，再用洗脫液洗脫達(dá)到分離和富集的目的。筆者選取和液相色譜柱同樣填料的固相萃取柱（C18），采用甲醇作為洗脫液進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，選擇5 mL甲醇洗脫可以有效的將待測(cè)組分洗脫分離，紫杉醇的回收率達(dá)到預(yù)期值。

釋放度測(cè)定時(shí)，對(duì)加入增溶物如表面活性劑和電解質(zhì)有一定的要求，不提倡向釋放介質(zhì)中加入醇類溶劑。紫杉醇為難溶藥物，在常用的pH 6.8 PBS、pH7.4 PBS等介質(zhì)中均難溶解。筆者曾嘗試以PBS（pH 7.4）-吐溫80（0.5%）作為釋放介質(zhì)，結(jié)果紫杉醇釋放較為緩慢，且體外釋放度結(jié)果的測(cè)定對(duì)吐溫80的純度要求很高，否則易產(chǎn)生噪聲大、基線不穩(wěn)、柱壓升高、柱效降低等情況。筆者選擇水楊酸鈉（1 mol·L－1）-PBS（pH 7.4）為體外釋放介質(zhì)，紫杉醇在1 mol·L－1水楊酸鈉中的溶解度為28.1 μg·mL－1[8]，因而將藥物最終釋放的濃度定為9 μg·mL－1，以滿足漏槽條件。

傳統(tǒng)的脂質(zhì)納米粒的體外釋放研究方法主要為透析法[10]。此方法下納米粒與透析袋內(nèi)少量的釋放介質(zhì)接觸，藥物從納米粒中擴(kuò)散至袋內(nèi)釋放介質(zhì)后，再通過透析袋擴(kuò)散至大量釋放介質(zhì)中。由于透析袋內(nèi)外的藥物濃度梯度較小，藥物的被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)行得較慢，使得釋藥速率顯著偏小。試驗(yàn)中以透析法測(cè)得紫杉醇體外釋放度24 h僅達(dá)到約15%。本文采用總體液平衡反向透析法測(cè)定紫杉醇納米粒的體外釋放，由于納米粒直接與釋放介質(zhì)接觸并被大量稀釋，故能更好地模擬藥物靜脈注射后到達(dá)體內(nèi)的狀態(tài)。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，透析袋對(duì)紫杉醇并無明顯阻滯作用，紫杉醇溶液在4 h基本透過透析袋，且透膜速率明顯快于納米粒的釋放速率；紫杉醇脂質(zhì)納米粒釋放均最優(yōu)擬合為一級(jí)釋放模型。

由于體外釋放的條件與體內(nèi)血液環(huán)境并不相同，因此體外釋放的測(cè)定結(jié)果并不能完全真實(shí)反映該脂質(zhì)體在體內(nèi)的釋放情況，故紫杉醇脂質(zhì)納米粒給藥系統(tǒng)的體內(nèi)吸收與體外釋放的相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究。

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