王 超，潘建偉

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004)

內(nèi)吞作用(endocytosis)又稱入胞作用，是通過質(zhì)膜的變形運(yùn)動將細(xì)胞外物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)的過程.內(nèi)吞作用之所以讓很多生物學(xué)家沉迷了大半個世紀(jì)，是因為其具有多種重要的生物學(xué)功能，包括抗原呈遞、養(yǎng)分?jǐn)z取、凋亡細(xì)胞清除、病原體入侵、質(zhì)膜蛋白(如受體蛋白和運(yùn)輸?shù)鞍?的水平調(diào)控、胞內(nèi)外信號傳導(dǎo)等等［1-2］.

根據(jù)所轉(zhuǎn)運(yùn)的物質(zhì)大小和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的不同，可將內(nèi)吞作用大致分為五大類［3］:1)吞噬作用(phagocytosis):主要吸收大顆粒物質(zhì);2)大胞飲作用(macropinocytosis):主要吸收液相物質(zhì);3)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞(clathrin-mediated endocytosis，CME):吸收一些小分子物質(zhì)或病原體，或調(diào)控質(zhì)膜蛋白水平，需要動力蛋白(dynamin)的參與;4)小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞(caveolin-mediated endocytosis):功能與3)相似，也需要動力蛋白的參與;5)不依賴于動力蛋白的內(nèi)吞(dynamin-independent endocytosis):這類內(nèi)吞的功能與3)和4)相似，但機(jī)理仍不清楚.關(guān)于動植物內(nèi)吞的研究結(jié)果表明，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞是受體介導(dǎo)內(nèi)吞的主要方式之一，在質(zhì)膜蛋白內(nèi)吞及胞內(nèi)外信號傳導(dǎo)過程中起著重要的調(diào)控作用［4-5］.因此，該途徑成為動植物分子細(xì)胞生物學(xué)的研究熱點之一.本文著重介紹了最近幾年動植物中網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑的一些新進(jìn)展.

1 網(wǎng)格蛋白復(fù)合體的組成及其功能

自從1976年網(wǎng)格蛋白首次在動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)［4］后，至今，網(wǎng)格蛋白在動物細(xì)胞和酵母中已得到很好的鑒定.已知動物中有一個網(wǎng)格蛋白重鏈基因(clathrin heavy chain，CHC)和2個輕鏈基因(clathrin light chains，CLCs)，而酵母中編碼CHC和CLC的基因均為單拷貝基因［6］.網(wǎng)格蛋白是由3條重鏈和3條輕鏈組成的三腳架結(jié)構(gòu)，輕鏈與重鏈的C端相互結(jié)合.重鏈?zhǔn)侨_架結(jié)構(gòu)的主要骨架，輕鏈則用于調(diào)節(jié)網(wǎng)格蛋白籠型結(jié)構(gòu)的組裝和拆解.重鏈長約47.5 nm，厚約2 nm，由1 670多個氨基酸組成，可分為6個部分:N端區(qū)域、腳踝區(qū)、遠(yuǎn)端腿、膝、近端腿、三聚作用區(qū)域(又叫做hub)，N端區(qū)域由包括7個兩葉狀的β螺旋構(gòu)成，其他部分是由多個串聯(lián)的α螺旋構(gòu)成.輕鏈與重鏈的近端腿相互結(jié)合，多個三腳架結(jié)構(gòu)相互結(jié)合形成六邊形或五邊形的網(wǎng)格，多個網(wǎng)格組成一個籠型結(jié)構(gòu).網(wǎng)格蛋白(clathrin)因此得名.在細(xì)胞內(nèi)，3條輕鏈 CLCs分別與3條重鏈CHCs的HUB區(qū)形成一個三腳架的復(fù)合體，再與質(zhì)膜內(nèi)吞起始位點結(jié)合，共由36或60個三腳架復(fù)合體形成一個由12個五邊形和若干個六邊形組成的籠形結(jié)構(gòu)［7］，把內(nèi)陷質(zhì)膜包裹在籠形結(jié)構(gòu)中，其他輔助蛋白通過網(wǎng)格進(jìn)入籠形結(jié)構(gòu)中行使各自的生物學(xué)功能［6，8］.

重鏈CHC起到一個復(fù)合體腳手架的作用，而輕鏈CLC的作用則是調(diào)控復(fù)合體的裝配與穩(wěn)定性［4-5］.復(fù)合體在質(zhì)膜上形成籠形結(jié)構(gòu)即內(nèi)吞小窩(pits)后，輕鏈暴露在小窩外，能與細(xì)胞質(zhì)中的一些輔助因子如鈣離子、鈣調(diào)蛋白、Hsp70(uncoating ATPase)等接觸進(jìn)一步調(diào)控小窩的生物學(xué)功能［9-10］.輕鏈在體內(nèi)外均能被磷酸化.離體實驗表明，輕鏈能夠阻止網(wǎng)格蛋白重鏈的自由裝配［11］.暗示輕鏈具有多種網(wǎng)格蛋白復(fù)合體的調(diào)控作用.

網(wǎng)格蛋白復(fù)合體在細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中起到關(guān)鍵性調(diào)控作用.網(wǎng)格蛋白包被的小窩(clathrincoated pits，CCPs)在質(zhì)膜、反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)TGN(trans-Golgi network)、內(nèi)體(endosome)等細(xì)胞器之間的貨物轉(zhuǎn)運(yùn)具有貨物選擇性作用.包裹貨物和部分質(zhì)膜的小窩通過質(zhì)膜內(nèi)陷從細(xì)胞膜上脫離后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，形成網(wǎng)格蛋白包被小泡(clathrin-coated vesicles，CCVs).小泡上的包被迅速脫離，使得網(wǎng)格蛋白復(fù)合體重新回到質(zhì)膜上，同時，包裹貨物的小泡與內(nèi)體融合將貨物轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)體中，內(nèi)體通過不同的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑將貨物運(yùn)輸?shù)讲煌哪康牡?

網(wǎng)格蛋白除了介導(dǎo)膜蛋白等貨物進(jìn)行內(nèi)吞外，還具有多種生物學(xué)功能，如生長因子和受體的內(nèi)吞、病原體的入侵、突出的傳遞等［12］.最近的研究表明，在有絲分裂過程中，網(wǎng)格蛋白可與紡錘體結(jié)合，提高紡錘體的穩(wěn)定性，以促進(jìn)染色體的聯(lián)會.另外，網(wǎng)格蛋白可與微管或者微管相關(guān)蛋白直接結(jié)合來穩(wěn)定著絲粒［13］.在細(xì)胞有絲分裂過程中，網(wǎng)格蛋白包被的小泡連續(xù)形成，暗示著有絲分裂馬上要結(jié)束［13］.這些研究表明，網(wǎng)格蛋白參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程，對細(xì)胞生長發(fā)育、分化和環(huán)境響應(yīng)具有重要的生物學(xué)功能［14］.

2 接頭蛋白復(fù)合體的組成及其功能

在網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞過程中，接頭蛋白(adaptor proteins，APs)主要負(fù)責(zé)貨物蛋白的分揀(cargo protein sorting)，網(wǎng)格蛋白的招募(recruitment)、裝配和拆卸，以及輔助蛋白的招募等［15］.接頭蛋白與質(zhì)膜受體蛋白等貨物蛋白結(jié)合后，接頭蛋白才可招募網(wǎng)格蛋白和一些輔助蛋白因子.

目前已知有2類接頭蛋白分子［16-17］.第一類是最早發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典接頭蛋白，主要有4種:AP1，AP2，AP3和AP4，均為4個亞基組成的異源四聚體.AP1復(fù)合體主要作用于TGN的貨物分揀;AP2復(fù)合體作用于質(zhì)膜貨物分揀;AP3復(fù)合體可能作用于高爾基體至溶酶體之間的運(yùn)輸過程中的貨物分揀;AP4復(fù)合體，可能與TGN有關(guān)，目前機(jī)理尚不清楚［18-19］.目前，對AP2的研究相對較為深入，它主要作用于網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)膜內(nèi)吞與貨物分揀.AP2復(fù)合體由2個大亞基α和β2，1個中亞基μ2和1個小亞基σ2組成.這個復(fù)合體可以分為3個區(qū)域:C端是一個大亞基粘合在質(zhì)膜上的關(guān)鍵區(qū)域，N端是小亞基和中亞基構(gòu)成的核心區(qū)域及α和β2的鉸鏈.AP2大亞基α與質(zhì)膜上的磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol(4，5)-bisphosphate，PtdIns(4，5)P2/PIP2)或磷脂酰肌醇三磷酸(PtdIns(3，4，5)P3/PIP3)相結(jié)合［20］.大亞基 β2通過自身含有的網(wǎng)格蛋白結(jié)合序列LФxФD/E基序(motif)招募網(wǎng)格蛋白，此基序橫跨β2亞基的鉸鏈區(qū)［17］.中亞基μ2位于2個區(qū)，其N端1/3位于AP2的核心區(qū)域，C端2/3是與貨物分揀直接相關(guān)的一段YxxФ序列，C端還有一個磷脂酰肌醇二磷酸的結(jié)合位點［21］.當(dāng)AP2與質(zhì)膜的PIP2或PIP3結(jié)合后，其構(gòu)象發(fā)生變化，打開μ2亞基的YxxФ序列.有研究表明，這種構(gòu)象變化需要Ark激酶家族中的AAK1激酶的作用，使得本來μ2-β2相互作用的構(gòu)象發(fā)生磷酸化讓YxxФ序列得以打開［20］.小亞基 σ2的主要功能是穩(wěn)定復(fù)合體［22-23］.

另一類接頭蛋白是一類結(jié)構(gòu)非常簡單的蛋白因子，它們可以連接貨物進(jìn)入網(wǎng)格蛋白包被的小窩.典型的接頭蛋白如:GGAs［24］，epsins［25］，Hrs和disabled2［26］.這類蛋白也能夠與其他輔助蛋白結(jié)合，共同作用于內(nèi)吞途徑.GGAs是一個選擇性的網(wǎng)格蛋白接頭蛋白，對這些蛋白因子的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究.

3 動物細(xì)胞網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞

通過一些高技術(shù)的電子顯微鏡，能在形態(tài)學(xué)上觀察到附著在質(zhì)膜細(xì)胞質(zhì)面的包被.到目前為止，調(diào)節(jié)包被的形成和質(zhì)膜貨物的選擇主要有3類包被復(fù)合體:包被蛋白Ⅰ(coat protein-Ⅰ，COP-Ⅰ)、包被蛋白Ⅱ(COP-Ⅱ)和網(wǎng)格蛋白，其中COP-Ⅰ包被與高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜有關(guān)，COP-Ⅱ包被涉及從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的運(yùn)輸［27］.而網(wǎng)格蛋白包被參與2個重要的運(yùn)輸過程:1)從質(zhì)膜內(nèi)吞到與早期內(nèi)體(early endosome)融合;2)從反式高爾基網(wǎng)絡(luò)TGN內(nèi)吞到與內(nèi)體融合［15］.目前，對哺乳動物網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞過程研究得相對比較清楚，主要包括質(zhì)膜招募網(wǎng)格蛋白、質(zhì)膜內(nèi)陷、包被小窩CCPs的形成、包被小泡CCVs的形成和小泡包被的脫離等過程［1］.

3.1 質(zhì)膜招募

AP2復(fù)合體是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞的主要組件，它是質(zhì)膜蛋白與網(wǎng)格蛋白的連接紐帶，AP2的μ2亞基貨物分揀識別序列YxxФ基序特異性地選擇貨物蛋白，同時，大亞基β2通過網(wǎng)格蛋白結(jié)合序列LФxФD/E基序招募網(wǎng)格蛋白.在AP2復(fù)合體招募網(wǎng)格蛋白過程中，AP180起著重要的作用.它首先通過其保守區(qū)域N端區(qū)域(ANTH)與質(zhì)膜上的 PtdIns(4，5)P2 相互作用［28］，然后協(xié)助AP2招募網(wǎng)格蛋白到質(zhì)膜表面.AP180的C端具有很強(qiáng)的功能特異性，在網(wǎng)格蛋白招募過程中具有重要的生物學(xué)功能［29］.

3.2 小窩CCP的形成

在內(nèi)吞早期，質(zhì)膜招募網(wǎng)格蛋白除了需要接頭蛋白 AP2外，還需要多個輔助蛋白因子如AP180和epsin1等的協(xié)同作用，才能準(zhǔn)確地招募網(wǎng)格蛋白到質(zhì)膜上，從而促進(jìn)質(zhì)膜向內(nèi)凹陷形成小窩(CCP).AP180除了具有招募網(wǎng)格蛋白的功能外，還具有促進(jìn)質(zhì)膜內(nèi)陷的功能.有研究表明，在果蠅中，敲除AP180的同源基因后導(dǎo)致小窩CCP數(shù)量減少［29］.epsin1也是一個促進(jìn)質(zhì)膜內(nèi)陷的重要蛋白因子.有實驗證據(jù)表明，epsin1和網(wǎng)格蛋白共定位于內(nèi)陷的質(zhì)膜中，epsin1先與質(zhì)膜磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)結(jié)合，再與網(wǎng)格蛋白復(fù)合體相互作用，促進(jìn)質(zhì)膜凹陷［30］.epsinR是 epsin1的一個同源蛋白，它的主要功能是促進(jìn)囊泡從高爾基體TGN區(qū)運(yùn)輸?shù)絻?nèi)體上［31］.

3.3 小泡CCV的形成

網(wǎng)格蛋白包被的小窩CCP從質(zhì)膜脫離形成網(wǎng)格蛋白包被的小泡CCV.小窩CCP的形成受2個重要的輔助蛋白因子如兩性蛋白(amphiphysin)和動力蛋白(dynamin)的調(diào)控［32］.兩性蛋白結(jié)合于小窩莖質(zhì)膜上，將動力蛋白招募到小窩莖的部位，然后與動力蛋白相互作用，激活質(zhì)膜切斷的過程.動力蛋白是一個大GTP酶蛋白家族，在動植物和酵母中高度保守，其主要作用是調(diào)控小窩CCP從質(zhì)膜上脫離，形成小泡 CCV［33］.實驗證據(jù)表明，動力蛋白在兩性蛋白的作用下纏繞內(nèi)吞小窩的莖部位，然后催化GTP水解導(dǎo)致小窩莖部位的斷裂，從而釋放小窩 CCP，形成小泡 CCV［34］.最近的研究發(fā)現(xiàn)，在小泡CCV形成過程中也受另一類小GTP酶如ADP糖基化因子(ADP ribosylation factors，ARFs)及其相關(guān)調(diào)控因子 GEF(guanine nucleotide exchange factors)和GAPs(GTPase activating proteins)的調(diào)控［35］.這些研究表明，小泡CCV的形成過程是一個由多種蛋白因子參與的復(fù)雜調(diào)控過程.

3.4 小泡包被的脫離

在小泡與早期內(nèi)體融合之前，網(wǎng)格蛋白必須從小泡上脫離.脫離過程需要 hsc70，auxilin和ATP的參與，以及 miRNA［36］，其可能的作用機(jī)制是破壞網(wǎng)格蛋白與接頭蛋白AP2之間的連接，從而釋放網(wǎng)格蛋白［37］.釋放后的網(wǎng)格蛋白通過再循環(huán)(recycling)途徑被招募到質(zhì)膜內(nèi)吞起始位點或進(jìn)入降解途徑.

4 植物細(xì)胞網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞

由于植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁和較高的細(xì)胞膨壓，因此，20世紀(jì)80年代曾經(jīng)針對植物細(xì)胞是否存在像動物一樣的內(nèi)吞及其生理學(xué)意義開展過激烈的討論［38］.但隨后的電子顯微鏡觀察表明，在植物細(xì)胞中的確存在內(nèi)吞現(xiàn)象，并且細(xì)胞膨壓并沒有阻止內(nèi)吞的發(fā)生［39］.

在哺乳動物細(xì)胞中，酪氨酸磷酸化抑制劑A23通過特異性地抑制貨物蛋白Yxx?序列與AP2亞基μ2的相互作用，從而阻止網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞的發(fā)生［40］.最近幾年的藥理學(xué)實驗表明，A23也同樣有效地抑制植物細(xì)胞發(fā)生內(nèi)吞［41］.通過免疫電鏡觀察到網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞的發(fā)生過程［41］.這些結(jié)果暗示，在植物細(xì)胞中很可能也存在類似于動物細(xì)胞網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制.生物信息學(xué)分析表明，在擬南芥基因組中存在2個網(wǎng)格蛋白重鏈基因CHCs和3個輕鏈基因CLCs，以及一些重要的內(nèi)吞調(diào)控基因，如編碼AP2復(fù)合體亞基，AP180，hsc70，epsin，dynamin 和 amphiphysin等的同源基因［42-43］(見表 1).最近的遺傳學(xué)實驗表明:敲除一個CHC基因引起部分胚胎、子葉發(fā)育、生長素極性分布不正常;同時敲除2個CHC基因引起胚胎致死［44］.這些研究結(jié)果表明，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞在植物生長發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用.

表1 植物網(wǎng)格蛋白、接頭蛋白和一些重要的輔助蛋白

至今，有證據(jù)表明，植物網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞參與調(diào)控細(xì)胞極性的建立、細(xì)胞分裂、細(xì)胞壁的形成、根毛和花粉管等的頂端生長、胚胎發(fā)生、配子體發(fā)生、防御和抗逆反應(yīng)等［45］，暗示網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞是植物細(xì)胞膜蛋白內(nèi)吞的主要途徑，也是植物生長發(fā)育在逆境響應(yīng)過程中呈現(xiàn)可塑性的重要機(jī)制之一.植物生長素是調(diào)控植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)的重要激素之一，其極性運(yùn)輸方式是其他激素所沒有的.生長素輸出載體PIN在細(xì)胞膜上的極性定位決定了生長素的極性流向和梯度分布［46-47］，而生長素的極性流向和梯度分布對植物胚胎和器官的極性發(fā)育、向性生長等重要的生命活動過程中起著重要的作用［48-49］.外源生長素和A23均可有效地抑制PIN蛋白的內(nèi)吞［50］，暗示外源生長素通過調(diào)控網(wǎng)格蛋白的生物學(xué)功能來調(diào)控PIN蛋白的內(nèi)吞.這些研究結(jié)果表明，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞在生長素極性運(yùn)輸中具有重要的調(diào)控作用.最近的研究表明，生長素受體abp1突變體中生長素不能抑制PIN蛋白的內(nèi)吞［51］，同樣說明了生長素調(diào)控PIN的內(nèi)吞是通過調(diào)控網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞來實現(xiàn)的.重鏈T-DNA插入單突變體chc2除15%～20%的幼苗出現(xiàn)不正常的子葉外，其余幼苗均表現(xiàn)為野生型表型;chc1-1chc2-1雙突變體引起胚胎致死，從而影響重鏈CHC活體生物學(xué)功能的鑒定.然而，植物網(wǎng)格蛋白輕鏈的生物學(xué)功能至今仍沒有被鑒定.

5 結(jié)論

已知網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制是一個相對保守的內(nèi)吞機(jī)制，在動物中已有廣泛、深入的研究，人們對其本身的分子機(jī)理已有較深入的了解.盡管已知網(wǎng)格蛋白能夠介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和質(zhì)膜受體的內(nèi)吞，但細(xì)胞通過什么機(jī)制來誘導(dǎo)啟動和終止這一重要的生命現(xiàn)象?目前仍不清楚.另外，網(wǎng)格蛋白在細(xì)胞藥物選擇性吸收、腫瘤發(fā)生過程中的分子機(jī)理仍有待于進(jìn)一步的研究.

已有大量的實驗證據(jù)表明，在植物細(xì)胞中也同樣存在內(nèi)吞，并且參與調(diào)控多個發(fā)育過程.近幾年來，對植物網(wǎng)格蛋白的研究也取得了較大的進(jìn)展，但與動物相比，仍相對比較落后.在網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞過程中，對內(nèi)吞貨物的特異性選擇機(jī)制仍不清楚，許多重要輔助蛋白因子仍沒有得到鑒定，植物根系是否通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑從土壤中吸收營養(yǎng)物質(zhì)仍需要進(jìn)一步的遺傳與分子證據(jù).這些科學(xué)問題很可能成為今后幾年植物學(xué)研究領(lǐng)域中的新熱點.

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