李麗莉 楊蕾 陳保文 都偉欣 盧錦標(biāo) 白東亭 王國(guó)治

2011年7月20日，WHO公布的一項(xiàng)政策建議中指出：使用目前市面上商業(yè)性血液（血清學(xué)）檢測(cè)手段診斷活動(dòng)性結(jié)核病，常常導(dǎo)致誤診和不當(dāng)治療，進(jìn)而損害公眾健康。WHO敦促各國(guó)采用其推薦的準(zhǔn)確的微生物或分子檢測(cè)方法，禁止使用不準(zhǔn)確的和未經(jīng)批準(zhǔn)的血清學(xué)檢測(cè)方法［1］。該報(bào)告中還稱：大量證據(jù)表明，與WHO推薦的檢測(cè)方法相比，血清學(xué)檢測(cè)產(chǎn)生大量假陽(yáng)性或假陰性的錯(cuò)誤結(jié)果［1］。

WHO公布的“關(guān)于活動(dòng)性結(jié)核病檢測(cè)手段”的政策建議，引起國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）以及SFDA相關(guān)部門的高度重視，2012年4月16日，SFDA發(fā)布了《關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)結(jié)核病血液檢測(cè)試劑監(jiān)管有關(guān)事宜的通知》（食藥監(jiān)辦械［2012］48號(hào)），要求各省、自治區(qū)、直轄市食品藥品監(jiān)督管理局按照通知要求對(duì)行政區(qū)域內(nèi)有關(guān)結(jié)核病血液檢測(cè)試劑的注冊(cè)審評(píng)情況開展檢查，試圖通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)生產(chǎn)結(jié)核病診斷血清學(xué)制品的企業(yè)進(jìn)行一次背景調(diào)查，分析目前國(guó)內(nèi)結(jié)核病血清學(xué)檢測(cè)試劑在生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)量控制和在臨床評(píng)價(jià)中存在的問題及解決問題的方法。

一、我國(guó)目前結(jié)核病血清學(xué)檢測(cè)試劑的使用情況分析

（一）我國(guó)結(jié)核病血清學(xué)檢測(cè)試劑現(xiàn)狀

在我國(guó)結(jié)核病臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)中，血清學(xué)檢測(cè)是結(jié)核病輔助診斷的重要診斷試劑之一。市場(chǎng)上銷售的結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑有近百家，經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的國(guó)產(chǎn)診斷制品抗體檢測(cè)試劑盒29個(gè)，其中經(jīng)國(guó)家級(jí)批準(zhǔn)的26個(gè)，省級(jí)批準(zhǔn)的3個(gè)；進(jìn)口制品1個(gè)?？乖瓩z測(cè)試劑盒3個(gè)，其中省級(jí)批準(zhǔn)的1個(gè)。大多數(shù)未經(jīng)批準(zhǔn)的結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑游離于國(guó)家監(jiān)管范圍之外，值得引起國(guó)家有關(guān)部門及人員的關(guān)注與重視。

（二）結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)背景調(diào)查情況介紹

本次調(diào)研根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局的通知要求，對(duì)行政區(qū)域內(nèi)有關(guān)結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑的注冊(cè)審評(píng)情況開展檢查，并組織行政區(qū)域內(nèi)有關(guān)生產(chǎn)企業(yè)按照要求填報(bào)相關(guān)資料。調(diào)查資料的內(nèi)容主要包括試劑盒背景資料，試劑盒成品檢測(cè)，試劑盒檢測(cè)參考品制備與標(biāo)化，參考品使用情況及臨床研究等方面。通過(guò)對(duì)各生產(chǎn)企業(yè)報(bào)送的資料進(jìn)行分析，共收回調(diào)查問卷29份。我國(guó)目前結(jié)核病血清學(xué)診斷制品的品種與近3年的數(shù)量見表1。由于無(wú)法掌握未經(jīng)批準(zhǔn)的結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑的非法銷售情況，表1結(jié)果并不能代表國(guó)內(nèi)實(shí)際銷售狀況。

表1 我國(guó)結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑近3年產(chǎn)量分析

二、結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑存在的問題和建議

（一）陽(yáng)性參考品的選擇

多數(shù)企業(yè)在陽(yáng)性參考品選擇時(shí)通常只選擇菌陽(yáng)患者抗體強(qiáng)陽(yáng)性血清，如果試劑某批次質(zhì)量出現(xiàn)問題，敏感度偏低時(shí)，若陽(yáng)性參考品中全部使用強(qiáng)陽(yáng)性血清，所有陽(yáng)性參考品反應(yīng)均呈陽(yáng)性，則無(wú)法反映該試劑的真實(shí)敏感度，如標(biāo)準(zhǔn)品中有弱陽(yáng)性血清的反應(yīng)可能呈陰性，提示試劑敏感度可能存在問題。因此，血清學(xué)抗體檢測(cè)試劑在質(zhì)量控制中需要強(qiáng)、中、弱三種不同效價(jià)的血清用于敏感度的質(zhì)量控制。同理，在試劑制備過(guò)程出現(xiàn)問題，可能產(chǎn)生假陽(yáng)性時(shí)，如果陰性參考血清都選擇本底極低的樣品，可能無(wú)法檢出，因此陰性參考品應(yīng)含有臨界陰性參考血清［2］。

（二）參考品的標(biāo)化

為獲得陽(yáng)性與陰性不同效價(jià)的血清，獲得血清后應(yīng)先進(jìn)行初篩，再用不同的方法學(xué)對(duì)血清進(jìn)行效價(jià)標(biāo)定，確定血清的效價(jià)，從中選擇不同反應(yīng)強(qiáng)度的樣本，作為陽(yáng)性或陰性參考品。但多數(shù)企業(yè)未進(jìn)行細(xì)致的效價(jià)標(biāo)化，通常以試劑盒篩選后就作為檢測(cè)參考品。

同時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品的建立應(yīng)有規(guī)范的操作細(xì)則，至少樣品采集、檢測(cè)與標(biāo)化的過(guò)程中所有的實(shí)驗(yàn)操作均需先制定標(biāo)準(zhǔn)操作方法（standard operating procedure，SOP），再嚴(yán)格遵循SOP進(jìn)行操作，并有對(duì)應(yīng)的原始記錄。目前，從已收到的資料來(lái)看，多數(shù)企業(yè)存在不足之處。

（三）參考品的制備

結(jié)核病體外診斷試劑參考品通常由陽(yáng)性參考品、陰性參考品、最低檢出量或最低檢出限參考品和精密性或重復(fù)性參考品組成，用來(lái)控制試劑盒的敏感度、特異度、檢出限和精密度等。但部分試劑廠家僅有陽(yáng)性與陰性檢測(cè)參考品［3］。

由于參考品用于體外診斷試劑質(zhì)量控制，所以參考物質(zhì)原料的選擇取決于診斷試劑的預(yù)期用途。原料應(yīng)與試劑盒的使用要求相一致或盡可能接近，這樣可以消除方法基體效應(yīng)引入的系統(tǒng)誤差［2］，陽(yáng)性參考品應(yīng)包括痰菌陰性和痰菌陽(yáng)性患者的血清，但個(gè)別企業(yè)僅采用采血站篩選的抗體陽(yáng)性血清作為陽(yáng)性參考品。

（四）參考品的穩(wěn)定性

參考物質(zhì)的均一性和穩(wěn)定性：均一性可保證一批原料所制備的參考品均勻一致，即在不同空間檢測(cè)結(jié)果的一致性和可比性；穩(wěn)定性可使一批參考品長(zhǎng)期分發(fā)使用，為企業(yè)或科研院所提供用于質(zhì)量評(píng)價(jià)的參考品，保證在不同時(shí)間檢測(cè)結(jié)果的一致性和可比性。穩(wěn)定性考察一般需要觀察在不同溫度下放置不同時(shí)間，或經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融后，觀察效價(jià)降低的情況。通過(guò)測(cè)定不同溫度，不同凍融次數(shù)時(shí)特征活性的降低速率，從而確定貯存的適宜溫度和時(shí)間，或反復(fù)凍融的次數(shù)。

（五）參考品制備與檢測(cè)的安全性

血液（抗體、抗原和γ－干擾素）檢測(cè)試劑盒的參考物質(zhì)主要來(lái)源于感染者或疑似感染者的血液樣本，另外，對(duì)于以人為來(lái)源的生物材料作為參考品原料或輔料，因其具有傳染性，一定要注意實(shí)驗(yàn)室安全性［4］。

三、臨床研究方面存在的問題與建議

（一）敏感度與特異度虛高

WHO評(píng)估結(jié)果顯示，市售不同廠家的血液（血清學(xué)）診斷試劑的敏感度和特異度變化很大，敏感度變化范圍為0%～100%，特異度變化范圍為31%～100%［1］。根據(jù)收集的各企業(yè)臨床資料顯示：我國(guó)血液診斷試劑的敏感度平均值為80%左右，高于70%的占79%；特異度平均值為92%，高于90%的占95%。我國(guó)試劑調(diào)查結(jié)果與WHO的評(píng)估結(jié)果相比，我國(guó)試劑敏感度和特異度變化范圍較小，而且變化范圍相對(duì)集中。根據(jù)多年來(lái)我國(guó)結(jié)核病血清學(xué)抗體檢測(cè)試劑質(zhì)量評(píng)價(jià)的經(jīng)驗(yàn)，目前的血清學(xué)抗體檢測(cè)試劑，由于抗原種類和檢測(cè)方法的原因，敏感度和特異度不可能同時(shí)達(dá)到很高的水平。事實(shí)上，該類產(chǎn)品若要達(dá)到高的敏感度，就必然會(huì)犧牲一定的特異度；特異度高，則必然以犧牲一部分敏感度為前提。但在此次調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，為數(shù)不少的產(chǎn)品臨床研究得到的敏感度和特異度均超過(guò)了90%（敏感度和特異度均在90%以上的產(chǎn)品比例為26%），超出了筆者對(duì)該方法學(xué)的認(rèn)識(shí)，這些數(shù)據(jù)的真實(shí)性存在疑問，其產(chǎn)生的原因可能是臨床研究與數(shù)據(jù)處理不夠嚴(yán)謹(jǐn)，造成統(tǒng)計(jì)結(jié)果的偏差。因?yàn)樘峤毁Y料的廠家均未提供詳細(xì)的臨床研究資料，所以還需進(jìn)行進(jìn)一步的調(diào)研。

（二）臨床評(píng)價(jià)僅采用與同類制品進(jìn)行比較評(píng)價(jià)的缺陷

部分企業(yè)根據(jù)《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》［5］，“已有同品種批準(zhǔn)上市”產(chǎn)品的臨床研究可采用已批準(zhǔn)上市、質(zhì)量較好的產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)研究。只用兩種同類試劑進(jìn)行比較，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果不一致率可能較低。但若將血清學(xué)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，則可能會(huì)出現(xiàn)兩種血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果均與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不一致率高的現(xiàn)象。即只用同類制品進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，無(wú)法體現(xiàn)臨床陽(yáng)性檢出的真實(shí)情況［4］。

實(shí)際《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中對(duì)“新診斷試劑產(chǎn)品”和“已有同品種批準(zhǔn)上市”產(chǎn)品的臨床研究的研究對(duì)象選擇的規(guī)定原則相同，即：“研究對(duì)象應(yīng)包括兩組：一組是用金標(biāo)準(zhǔn)確定為有某種疾病的患者組，另一組是用金標(biāo)準(zhǔn)證實(shí)無(wú)該病的患者或正常人群，作為對(duì)照組”。根據(jù)這一要求，臨床研究無(wú)論采取哪種方式進(jìn)行，都要求收集所有入選者臨床診斷的數(shù)據(jù)。

（三）臨床研究的規(guī)范性

對(duì)此次調(diào)查收集到的臨床研究進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)未規(guī)范進(jìn)行臨床研究，不能隨機(jī)入選客觀評(píng)價(jià)，數(shù)據(jù)經(jīng)處理修改痕跡明顯，這是導(dǎo)致臨床研究的特異度與敏感度不真實(shí)的主要因素。因此，應(yīng)建立規(guī)范的評(píng)價(jià)方法，臨床研究?jī)?nèi)容與過(guò)程應(yīng)盡可能與試劑臨床使用一致，建議：（1）疑似結(jié)核病患者隨機(jī)入組，依據(jù)《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS288－2008）》［7］將入選者分為結(jié)核病患者組（臨床診斷患者與確診患者）計(jì)算敏感度，非結(jié)核病對(duì)照組計(jì)算特異度［7］。（2）細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢查陽(yáng)性檢出結(jié)果分析。結(jié)核病患者組檢出結(jié)果分析：培養(yǎng)陽(yáng)性樣本的陽(yáng)性總檢出率分析包括：痰涂片和培養(yǎng)均為陽(yáng)性（涂陽(yáng)培陽(yáng)），以及痰涂片陰性和培養(yǎng)陽(yáng)性（涂陰培陽(yáng)），所有陽(yáng)性樣本合起來(lái)（涂陽(yáng)培陽(yáng)、涂陰培陽(yáng)樣本）計(jì)算陽(yáng)性檢出率分析。培養(yǎng)陰性樣本的陰性總檢出率分析包括：痰涂片和培養(yǎng)均為陰性（涂陰培陰），以及痰涂片陽(yáng)性和培養(yǎng)陰性（涂陽(yáng)培陰），所有陰性樣本（涂陰培陰、涂陽(yáng)培陰）合起來(lái)計(jì)算陰性檢出率分析。（3）與同類制品檢測(cè)結(jié)果比較分析。必要時(shí)可與同類制品進(jìn)行符合率比較，二者不一致時(shí)依據(jù)《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS288－2008）》［7］要求的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（或其他適宜方法或試劑）判斷各樣本檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

四、小結(jié)

（1）血清學(xué)檢測(cè)試劑不能作為結(jié)核病確診方法，但是可作為結(jié)核病的輔助診斷手段，我國(guó)結(jié)核病菌陰患者占70%以上［8］，結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑作為菌陰肺結(jié)核的輔助診斷手段之一依然有存在必要。（2）試劑盒質(zhì)量應(yīng)嚴(yán)格控制，進(jìn)一步完善產(chǎn)品質(zhì)量控制，對(duì)質(zhì)量不好的產(chǎn)品，應(yīng)進(jìn)行整改。（3）客觀的臨床評(píng)價(jià)是質(zhì)量考核的重要依據(jù)，建議制定結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑臨床評(píng)價(jià)指南，在有可能的情況下，對(duì)上市產(chǎn)品進(jìn)行臨床評(píng)估，擇優(yōu)推廣。（4）對(duì)于非法銷售的產(chǎn)品，因其質(zhì)量無(wú)法控制，應(yīng)予以取締。

［1］World Health Organization.World Health Organization（2011）policy statement：commercial serodiagnostic tests for diagnosis of tuberculosis.Geneva：WHO，2011.

［2］中國(guó)生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì).中國(guó)生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（2000年版）.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

［3］陳保文，都偉欣，王國(guó)治，等.結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(cè)試劑生產(chǎn)質(zhì)量控制與臨床研究概述.中國(guó)防癆雜志，2012，34（8）：546－549.

［4］中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì).結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程.北京：中國(guó)教育出版社，2006：8－45.

［5］中華人民共和國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則.北京：中華人民共和國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局，2007：3.

［6］中華人民共和國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法（試行）.北京：中華人民共和國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局，2007：2.

［7］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.WS288－2008肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn).北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：2－3.

［8］全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組，全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室.2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告.中國(guó)防癆雜志，2012，34（8）：485－508.