晚期肺腺癌外周血TS mRNA表達與培美曲塞治療療效的關(guān)系

孫 哲 ，余 鋒 ，衣玉麗 ，章 潔 ，汪小浪

（南昌大學(xué)a.第一附屬醫(yī)院腫瘤科；b.護理學(xué)院；c.醫(yī)學(xué)院生化教研室，南昌 330006）

在選用培美曲塞作為晚期肺腺癌患者的化療方案時先檢測患者外周血胸苷酸合成酶（TS）mRNA表達的情況來預(yù)測培美曲塞給患者帶來的益處，能更加有針對性的選用化療方案，從而進行個體化治療。檢測患者外周血TS mRNA的表達比檢測腫瘤組織中TS表達更方便易行。本文應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)技術(shù)（RT-PCR）檢測晚期肺腺癌患者化療前TS mRNA水平并分析其與培美曲塞治療療效的關(guān)系,以探討其在預(yù)測晚期肺腺癌化療療效方面的臨床應(yīng)用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇 2009年 6月至 2011年12月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的Ⅲ、Ⅳ期晚期肺腺癌患者29例。納入標準:年齡＜70歲；體力狀況（ECOG）評分＜2分；經(jīng)組織病理學(xué)確診為腺癌；根據(jù)UICC肺癌分期標準為Ⅲ期或Ⅳ期；未接受過手術(shù)、放化療和靶向治療;有可測量病灶；肝腎功能正常，無化療禁忌，且預(yù)計生存期大于3個月；取得患者及家屬同意。

1.2 主要試劑及儀器

Trizol（Invitrogen 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Qiagen公司），PCR擴增試劑盒（上海生工），引物由primer premier5.0軟件系統(tǒng)設(shè)計，TS引物序列:5’2 CTTCAGCGAGAACCCAGACC23’，5’2 TCCAGCCCAACCCCTAAAGAC23’，PCR 產(chǎn)物長度192 bp。

1.3 化療方案

培美曲塞 500 mg·m-2靜脈點滴，第1天;順鉑75 mg·m-2靜脈點滴，第1天。21 d為1周期。用藥前 24 h口服地塞米松 4 mg，2次·d-1，連服 3 d；用藥前1周給予VitB121000 μg單次肌內(nèi)注射，并予葉酸 400 μg，1 次·d-1，連服至培美曲塞結(jié)束后 21 d。

1.4 療效評價

化療2周期后按RECIST1.1實體瘤療效評價標準評價療效。有效組為完全緩解（CR）和部分緩解（PR），無效組為穩(wěn)定（SD）和疾病進展者（PD）。

1.5 外周血TS mRNA表達檢測

采用RT-PCR檢測患者化療前外周血中TS mRNA的表達水平。對所有的肺癌患者于治療前抽取外周靜脈血5 mL,EDTA抗凝。用淋巴細胞分離液分離出白細胞。按照Trizol Reagent說明提取外周血的總RNA，-70℃保存，備用。RNA-cDNA特異序列逆轉(zhuǎn)錄:30 ℃ 10 min，42 ℃ 35 min，99 ℃ 5 min，4℃5 min；瞬間離心5～10 s。PCR特異序列擴增:PCR 反應(yīng)體系 25 μL，其中 cDNA 2 μL，10×PCR 緩沖液 4 μL，TaqDNA 聚合酶（1 U·μL-1）1 μL，4 種dNTP 混合物（2 mmol·L-1）2.5 μL，MgCl2（25 mmol·L-1）1.5 μL，上下游引物各 0.04 μL，用無 RNA 酶去離子水定容至25 μL。以三磷酸甘油醛脫氫酶（glycer-aldehydephosphatedehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)對照，與目的基因同管擴增。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min后，進行 35 個循環(huán)（94 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s），4℃冷卻，同時cDNA在同一反應(yīng)條件下，用GAPDH上下游內(nèi)引物各10 μL，同樣條件30個循環(huán)，最后72℃延伸7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物分析:用1.5%的瓊脂糖凝膠，厚度約4 mm，上樣擴增產(chǎn)物 10 μL，每 cm 電壓為 80 V，電泳 30 min，在SZD700凝膠成像系統(tǒng)下攝像分析。并計算目的片段的灰度，分別與其內(nèi)參GAPDH的灰度作比較分析（TS/GAPDH）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

化療2周期后，根據(jù)化療療效分組，29例中有效組 7例（CR 1例，PR 6例），無效組 22例（SD 16例，PD 6例）。有效組外周血 TS mRNA的表達為0.66±0.12，無效組為 1.23±0.21，有效組明顯低于無效組，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

培美曲塞（pemetrexed，MTA，LY231514）是基于經(jīng)典的抗代謝類藥物甲氨蝶呤和氟尿嘧啶基礎(chǔ)上研制的新一代抗代謝藥，由禮來公司（EliLily，Inc）研發(fā)。除FDA批準的適應(yīng)證:惡性胸膜間皮瘤和非小細胞肺癌外，培美曲塞單藥或聯(lián)合化療對多種腫瘤有明顯的治療作用。培美曲塞能夠通過干擾葉酸代謝和DNA的合成來抑制腫瘤生長。培美曲塞的作用靶點在于嘧啶和嘌呤合成過程中的多種酶。其中之一是作用于TS，此作用與氟尿嘧啶（FU）類似，TS是胸苷酸合成中的限速酶，在DNA合成中充當(dāng)著關(guān)鍵作用，由于對TS的抑制，故DNA合成所必須的可利用的胸腺嘧啶減少，接著就造成細胞增殖下降，特別是在快速增殖的腫瘤細胞［1］。

有4項培美曲塞與鉑類藥物聯(lián)合一線治療晚期NSCLC的Ⅱ期臨床研究［2-5］結(jié)果表明，培美曲塞與鉑類聯(lián)合方案的療效與其他常用的含鉑兩藥聯(lián)合方案相似，而毒性反應(yīng)的發(fā)生率則明顯較低。

化療在癌癥的治療中占重要地位，然而化療并非對所有的癌癥患者都有效，如何使癌癥化療更具針對性、有效性、減少盲目性，已成為當(dāng)前研究的熱點。有很多研究證明肺腺癌中TS呈顯著的高表達［6］，TS對肺癌的預(yù)后同樣非常有意義。非小細胞肺癌的惡性程度也同TS的高表達有關(guān)［7-8］。既往研究表明，腫瘤內(nèi)TS水平的高低能夠預(yù)測TS相關(guān)治療的療效［9］。那么外周血TS mRNA的表達水平能不能預(yù)測培美曲塞的療效？本研究的結(jié)果顯示:臨床有效（CR+PR）的患者外周血TS mRNA表達水平低于穩(wěn)定（SD）和疾病進展（PD）的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。因此，晚期肺腺癌外周血中TS轉(zhuǎn)錄水平對培美曲塞治療療效的預(yù)測有一定的價值。

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