熱習服對高溫力竭運動大鼠體液調節(jié)激素及下丘腦抗利尿激素合成的影響

董柔 封文平 曾凡星 陳宜威

1西南林業(yè)大學體育部（云南昆明650224）2北京體育大學 3國家體育總局體育科學研究所

運動對體內水分、電解質及其調節(jié)激素（主要有醛固酮、心鈉素、抗利尿激素）產(chǎn)生重要的影響。運動過程中伴隨大量的水分和電解質的丟失，血漿激素水平發(fā)生改變［1，2］。 在高溫環(huán)境下運動，由于高溫和運動雙重因素的影響，機體上述變化更明顯。熱習服是提高機體在高溫環(huán)境下運動能力的有效手段。熱習服后，機體排汗能力增強，汗液中的電解質濃度更低，身體核心溫度升高更慢，但關于體液調節(jié)激素變化的報道較少。洪長青等［3］指出單純運動應激與單純熱應激不能獲得運動熱應激的適應，只有運動應激與熱應激的聯(lián)合刺激才可以獲得有效的運動熱應激適應。所以本實驗以運動熱應激作為熱習服的手段，經(jīng)過熱習服后再進行高溫力竭運動，探討力竭運動后大鼠血清體液調節(jié)激素的變化以及對下丘腦AVP合成的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組

SPF級成年雄性Wistar大鼠28只，購于北京維通利華實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2006-0009，體重 180~200 g。室溫 25℃，濕度50%，自由飲水進食。所有動物適應性飼養(yǎng)2天后，進行坡度0、速度16m/min、時間30min的適應性跑臺訓練2次，淘汰不運動的大鼠。剩余24只大鼠隨機分為空白對照組（A組）、高溫力竭組（B組）、熱習服后高溫力竭組（C組），每組8只。動物使用許可證號：SYXK（京 2006-0017）。

1.2 實驗方案

實驗在國家體育總局體育科學研究所綜合環(huán)境運動實驗室進行，設備為天津市森羅科技發(fā)展有限公司的CTDY-200型高溫高濕低氧訓練系統(tǒng)?？瞻讓φ战M無任何處理，第15天直接處死取材。高溫力竭組在溫度38℃、濕度50%環(huán)境下，以速度20 m/min、坡度0進行運動到力竭。熱習服后高溫力竭組連續(xù)在溫度38℃、濕度50%環(huán)境下以速度18 m/min、坡度0訓練14天，第15天同高溫力竭組作相同處理。動物力竭判斷標準：連續(xù)施加機械刺激后大鼠不能繼續(xù)跑動，下跑臺后腹部觸地并呈嚴重的“甲魚狀”。

每日記錄大鼠肛溫和體重。通過測試熱習服后高溫力竭組大鼠訓練后肛溫判斷大鼠是否熱習服，根據(jù)預試驗，發(fā)現(xiàn)在訓練第14天，訓練后大鼠肛溫與訓練前無差異，說明已習服。

1.3 取材

以3%戊巴比妥鈉按0.1ml/100g體重的劑量進行腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，其中1 ml注入有肝素的抗凝管，靜置1~2小時后，常溫下3000轉/分離心15分鐘分離血漿，隨即測試血漿滲透壓；剩余血液注入玻璃試管，靜置1~2小時后，常溫下3000轉/分離心15分鐘分離血清，-80℃冰箱保存待測。取血后迅速斷頭，取下丘腦，用鋁箔紙包好、標記后放入液氮急凍暫存，隨后放置于-80℃低溫冰箱保存待測。

1.4 實驗儀器和試劑

MULTISKAN MK3全自動多功能酶標儀：美國Thermo公司；Wellwash 4 Mk 2半自動洗板機：美國Thermo公司；Model2020型滲透壓儀：美國Advanced公司；Line-gene熒光定量PCR檢測系統(tǒng)：杭州博日科技有限公司；DYY-7C型電泳儀：北京六一儀器廠；DYCP-31D型水平式電泳槽：北京賓達英創(chuàng)科技有限公司；DSI-905鈉鉀氯鈣pH分析儀：中國上海。其他儀器如磁力攪拌器、恒溫振蕩器、分光光度計、培養(yǎng)箱等均為國產(chǎn)。

Tris、APS、SDS、TEMED、Tween-20、 丙烯酰胺、甘氨酸、甲叉雙丙烯酰胺、麗春紅等購自Sigma公司，AVP抗體購自Cell Signaling公司，內參、二抗購自Santa Cruz公司，其余常規(guī)化學試劑均為國產(chǎn)。

1.5 測試指標與方法

測試各組大鼠實驗前體重和B組、C組力竭后即刻體重。將數(shù)字體溫計插入大鼠肛門6.5 cm測得核心溫度［4］。用冰點滲透壓計測試含有離子血漿的冰點并折算為滲透壓。通過測定血清Na＋、K＋離子電極電位值，計算血清Na＋、K＋離子濃度。取-80℃冰箱保存待測血清，融化后放置至室溫，采用酶聯(lián)免疫法檢測血清抗利尿激素（ADH）、心鈉素（ANP）、醛固酮（ALD）濃度，嚴格按照Elisa試劑盒（購于RB公司）說明操作。

采用熒光定量PCR法測定大鼠下丘腦ADH mRNA表達：采用Primer premier 5及oligo 6生物軟件合成ADH基因及β-actin基因引物，其中β-actin為內參。ADH擴增片段長度 154 bp，上游：5’-AGCCCGAGTGTCGAGAGGT -3’， 下 游 ：5’ -TAGACCCGGGGCTTGGCAGA-3’；β-actin 擴增片段 長 度 383 bp， 上 游 ：5’-CACTATTGGCAACGAGCGGTTC-3’， 下游：5’-ACTTGCGGTGCACGATGGAG-3。北京尚柏抽提試劑盒獲取下丘腦總RNA，逆轉錄獲取cDNA后行PCR擴增。PCR反應條件：95℃預變性 2min，95℃變性 20 s，58℃退火 25 s，72℃延伸 30 s，45個循環(huán)，最后 95℃延伸 20 s，反應完畢后，行瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)對電泳條帶進行密度掃描。

1.6統(tǒng)計學分析

采用SPSS16.0軟件處理實驗結果，結果以均數(shù)±標準差（）表示。組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），先檢驗數(shù)據(jù)方差是否齊性，若方差齊性，則采用LSD檢驗方法；若方差不齊，則采用Tamhane’s T2檢驗方法。實驗前后肛溫和體重對比采用配對樣本t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 力竭運動時間

熱習服后高溫力竭組大鼠力竭運動時間（75.20±15.39min）顯著長于高溫力竭組大鼠（27.67±4.80min），P<0.01。

2.2 體重（表1）

高溫力竭組和熱習服后高溫力竭組大鼠體重較實驗前均顯著降低（P<0.01），熱習服后高溫力竭組大鼠體重丟失百分比顯著高于高溫力竭組 （P<0.01）。

2.3 肛溫（表2）

高溫力竭組和熱習服后高溫力竭組大鼠實驗后肛溫顯著高于實驗前（P<0.01）。

2.4 血漿滲透壓和血清激素（表3）

高溫力竭組大鼠血漿滲透壓與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），熱習服后高溫力竭組大鼠血漿滲透壓顯著高于空白對照組和高溫力竭組（P<0.01）。高溫力竭組和熱習服后高溫力竭組ADH濃度顯著高于空白對照組（P<0.05），同時熱習服后高溫力竭組顯著低于高溫力竭組（P<0.05）。高溫力竭組和熱習服后高溫力竭組ALD濃度顯著高于空白對照組（P<0.01）。高溫力竭組和熱習服后高溫力竭組ANP濃度顯著低于空白對照組（P<0.05）。

表3 各組大鼠血漿滲透壓（Posm）及血清激素濃度比較

2.5 Na+、K+濃度（表4）

高溫力竭組大鼠Na+濃度高于空白對照組 （P<0.05），熱習服后高溫力竭組顯著高于空白對照組和高溫力竭組（P<0.01）。高溫力竭組和熱習服后高溫力竭組大鼠Na+/K+與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

表4 各組大鼠血清Na+、K+濃度比較

2.6 下丘腦ADH mRNA表達（表5）

高溫力竭組大鼠下丘腦ADH mRNA表達顯著高于空白對照組（P<0.01），熱習服后高溫力竭組大鼠下丘腦ADH mRNA表達與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

表5 各組大鼠下丘腦ADH m RNA表達比較

3 討論

有報道指出，大鼠經(jīng)過高溫預處理24 h之后運動，耐力與對照組相比明顯提高，運動時間顯著延長，提示大鼠運動能力得到提高［5］。本實驗結果中，熱習服之后再進行高溫力竭運動，大鼠運動時間明顯延長，表明熱習服能提高大鼠在熱環(huán)境下的耐疲勞能力。

機體運動時肌肉產(chǎn)熱增加，高溫環(huán)境下運動，高溫和運動兩種效應疊加使核心溫度顯著上升［6］。多項研究［7，8］表明，體溫持續(xù)升高與高溫環(huán)境下運動能力下降相關。Hasegawa等［9］研究發(fā)現(xiàn)，運動時水分丟失是影響體溫升高的重要誘因之一。其他研究［10］表明，當運動員丟失相當于其體重1%的體液時，其正常生理功能就會改變。本實驗結果中，B組和C組大鼠進行高溫力竭運動后，體溫均升高且達到極限，說明體溫升高是限制其繼續(xù)運動的重要因素。C組大鼠體重丟失明顯高于B組，C組大鼠經(jīng)過熱習服，機體能更好散熱，在散熱的同時，體液大量丟失；同時C組大鼠運動時間明顯延長，運動中大量汗液丟失，上述兩個因素導致C組大鼠體液大量丟失。

ADH是體內調節(jié)水平衡的一個重要激素，具有促進水重吸收的作用。運動中ADH的分泌主要受血漿滲透壓、循環(huán)血量變化和動脈血壓變化的調節(jié)［11-13］。運動中，機體大量出汗、脫水，血漿滲透壓增高，刺激下丘腦的滲透壓感受器，引起ADH分泌增加，血漿ADH水平升高與血漿滲透壓濃度升高成正比。高溫力竭運動后，B組和C組大鼠水分大量丟失，血漿滲透壓增高，導致兩組大鼠血清ADH濃度升高。雖然C組大鼠經(jīng)過熱習服，在高溫環(huán)境下運動時間較長，體重丟失比B組大鼠更明顯，血漿滲透壓升高也更明顯，但C組大鼠血漿ADH濃度低于B組?？赡苁菬崃暦髾C體產(chǎn)生適應，不需要產(chǎn)生更多的ADH進行調節(jié)，下丘腦滲透壓感受器的“調定點”發(fā)生改變。

運動可導致血漿 ALD 顯著增加［14，15］。 中等強度長時間運動時，醛固酮的增加幅度較短時間大強度運動時大，說明醛固酮受運動時間影響較大，醛固酮的這種變化與血漿 ANP 相反［16，17］。 錢令嘉等［18］觀測了不同熱應激和熱習服水平的正常大鼠血漿ALD和體液Na+、K+濃度的變化，認為血漿ALD在熱環(huán)境中調控腎臟對 Na+、K+的排泌，ALD 分泌也受 Na+、K+濃度的影響。本研究結果顯示，B組和C組大鼠血清Na+/K+均升高，但兩組之間無顯著性差異，同時兩組血清ALD濃度升高，兩組之間也無顯著性差異，說明，高溫環(huán)境下運動，ALD分泌增加，腎臟重吸收Na+增加，進而引起水重吸收增加，維持水平衡。其他研究［19，20］也得出了相似的結論。

本實驗結果表明，高溫力竭和熱習服后高溫力竭組大鼠血清ANP水平下降較明顯，可能由于ANP抑制ADH和ALD的作用。由于運動負荷和熱負荷的刺激，機體需降低ANP的抑制作用，導致ANP分泌降低以適應高溫環(huán)境和運動的需要，減少Na+和水的排出，減少了對ALD和ADH釋放的抑制作用。此外，還與機體體液大量丟失，血漿容量減少導致心房充盈不足，對心房肌細胞的牽拉減少，使心房肌細胞釋放ANP減少有關。本實驗中，熱習服大鼠和未熱習服大鼠血清ANP濃度無差異，推測在高溫環(huán)境中運動，機體自身產(chǎn)熱及高溫熱輻射導致熱量在體內持續(xù)積累，使產(chǎn)熱率大于散熱率，體溫不斷上升并接近體溫調定點上限，機體嚴重脫水，血容量下降，心房肌分泌ANP減少。通過14天的熱習服，C組大鼠機體逐漸適應了血漿容量減少的刺激，分泌ANP逐漸增多，同時本實驗中，血清ADH濃度降低，ADH分泌減少，不需要ANP的抵抗作用，所以ANP分泌相應減少，最終導致熱習服未對血清ANP濃度產(chǎn)生明顯影響。

本研究結果表明，高溫力竭組大鼠下丘腦ADH mRNA表達比空白對照組高。這是由于高溫力竭運動后脫水嚴重，導致血容量降低，血清滲透壓濃度升高，滲透壓感受器及動脈壓力感受器發(fā)放持續(xù)信號刺激下丘腦分泌ADH。熱習服后高溫力竭組大鼠下丘腦ADH mRNA表達與高溫力竭組相比有降低趨勢，說明熱習服后再在高溫環(huán)境下運動，機體水合狀態(tài)保持較高水平，不足以動員下丘腦ADH mRNA高表達，下丘腦滲透壓感受器的“調定點”發(fā)生改變，血漿滲透壓升高未刺激下丘腦ADH mRNA表達上調。

4 小結

熱習服明顯提高大鼠在高溫環(huán)境下的運動能力。經(jīng)過熱習服后，血液中抗利尿激素濃度降低，下丘腦滲透壓感受器“調定點”上移，血漿滲透壓變化與下丘腦分泌ADH不一致。

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