劉穎，王顯國，張巨明＊，劉芳

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州510642；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京100193；3.全國畜牧總站，北京100193）

山野豌豆（Vicia amoena）又叫落豆秧、高蔓草藤、宿根苕子，為豆科巢菜屬多年生草本植物［1］。它表現(xiàn)出耐寒、抗旱、葉量大、粗蛋白及動物必需氨基酸含量高、適應(yīng)性廣、再生力強(qiáng)、容易繁殖、產(chǎn)量高、品質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)［2－5］。另外，山野豌豆不僅是一種優(yōu)良牧草，而且還是很好的防風(fēng)固沙水保植物［6］、改土肥田綠肥作物［7］和草坪及藥用植物［8］，具有推廣和應(yīng)用價(jià)值。目前SRAP（sequence related amplified polymorphism）標(biāo)記已在農(nóng)作物和園藝作物上有了較多成功的應(yīng)用，但SRAP在豆科牧草種質(zhì)資源上的應(yīng)用還非常少，僅在苜蓿（Medicago）［9－15］、大豆（Glycine）［16－18］、三葉草（Trifolium）［19，20］、山羊豆（Galege）［21］、小扁豆（Lens）［22，23］等屬有相關(guān)報(bào)道。本研究主要采用正交設(shè)計(jì)法對SRAP－PCR反應(yīng)條件中主要因子：Mg2＋、dNTP、引物、Taq酶進(jìn)行優(yōu)化分析并確定了模板DNA濃度，旨在篩選出一個(gè)適用于野豌豆屬的穩(wěn)定性及重復(fù)性好，多態(tài)性高的最佳反應(yīng)條件。此外，本研究還對部分SRAP引物組合進(jìn)行了多態(tài)性篩選，希望獲得一些多態(tài)性豐富的SRAP引物組合，為開展SRAP標(biāo)記技術(shù)在山野豌豆種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性等方面的分子生物學(xué)研究提供有利依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)所用5份山野豌豆材料采自全國3個(gè)不同的地域，優(yōu)化SRAP－PCR體系的DNA模板來自內(nèi)蒙古呼倫貝爾的9號、山西五臺山的6號及北京百花山的14號DNA；篩選引物所用DNA模板來自山西沁源的11號、北京靈山的5號及內(nèi)蒙古呼倫貝爾的9號DNA。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 PCR反應(yīng)體系設(shè)計(jì)與引物組合 采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對 Mg2＋、dNTP、引物、Taq DNA 聚合酶進(jìn)行4因素3水平篩選（表1）。體系優(yōu)化分別采用3份不同DNA進(jìn)行，每份DNA做2次重復(fù)，取其平均值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。體系總體積為25μL，除表中變化的因素外，每管中還加入2μL 10×PCR buffer和50ng的模板DNA，所用引物組合為Me2＋Em4。

1.2.2 SRAP－PCR擴(kuò)增程序及擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測SRAP－PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min；94℃變性1min，37℃退火45s，72℃延伸1min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性1min，50℃退火45s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸7min，4℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入5μL 6×loading Buffer緩沖液混勻，取8μL上樣于2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行分離。

1.2.3 模板DNA濃度優(yōu)化 應(yīng)用上述體系最佳組合，引物組合為 Me2＋Em4，DNA模板為5號DNA。將25μL擴(kuò)增體系中模板DNA用量分別設(shè)置6個(gè)梯度處理，即10，20，30，40，50和60ng，對反應(yīng)體系中的模板DNA濃度進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 多態(tài)性SRAP引物組合的篩選 根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果確定的SRAP－PCR最佳反應(yīng)體系，選取Li和Quiros［24］及Riaz等［25］發(fā)表的引物序列，包括7條正向引物和14條反向引物兩兩組合成98個(gè)SRAP引物組合（表2），對3份山野豌豆種源材料進(jìn)行多態(tài)性SRAP引物組合的篩選。

表1 SRAP－PCR［L9（34）］正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal design for SRAP－PCR ［L9（34）］

表2 SRAP引物序列Table 2 Primer sequences used for SRAP analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP－PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的擴(kuò)增結(jié)果分析

山野豌豆SRAP－PCR體系優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。參照何正文等［26］的方法，對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行直觀分析，依據(jù)譜帶的亮度、清晰度以及條帶數(shù)，將9個(gè)處理結(jié)果劃分為9個(gè)評分等級以便統(tǒng)計(jì)分析，內(nèi)蒙古呼倫貝爾的DNA擴(kuò)增結(jié)果得分為1，3，2，5，6，7，9，4和8。山西五臺山與北京百花山的DNA擴(kuò)增結(jié)果得分分別為1，6，7，8，5，2，9，3和4及6，7，4，3，5，1，9，2和8。3份不同種源的9個(gè)處理結(jié)果的總平均得分為2.67，5.33，4.33，5.33，5.33，3.33，9.00，2.67，6.67。得分最高為組合7帶型清晰，亮度高，且雜帶少，擴(kuò)增效果最好，選為山野豌豆基因組SRAP－PCR的最佳擴(kuò)增反應(yīng)體系。

參照張麗等［27］的方法，對各組分濃度組合的正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析（表3），其中T值代表某水平下某因子參與反應(yīng)所產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶的總和；K代表某因子在某水平參與反應(yīng)所產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶的平均值；R為某因子的極差，即某因子在不同水平下最大平均值與最小平均值之差。R值的大小反映了該因子對試驗(yàn)結(jié)果影響的大小，R值越大，影響越顯著。從R值可看出，在選定的3個(gè)水平范圍內(nèi)，4個(gè)因素對結(jié)果的影響由大到小依次為：引物＞ Mg2＋＞Taq DNA聚合酶＞dNTP。K值反映了影響因素各水平對反應(yīng)體系的影響情況，K值越大，反應(yīng)水平越好。從K值結(jié)果來看，引物以水平3最好，Mg2＋以水平2最好，Taq DNA聚合酶水平3最好，dNTP以水平1最好。綜上，各因素最佳的水平具體為引物2.0μmol／L、Mg2＋2.0mmol／L、Taq DNA 聚合酶1.5U、dNTP 0.2mmol／L，該組合與直觀分析得出的最佳組合7一致，進(jìn)一步確定組合7為最優(yōu)組合。

圖1 SRAP－PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of SRAP－PCR orthogonal design

2.2 模板DNA濃度的確定

應(yīng)用上述最佳反應(yīng)體系，對模板DNA設(shè)置了10，20，30，40，50和60ng 6個(gè)濃度梯度進(jìn)行優(yōu)化。擴(kuò)增結(jié)果表明，在25μL反應(yīng)體系中6種模板DNA用量均能擴(kuò)增出譜帶，且?guī)鸵恢隆５０錎NA濃度不同，譜帶的清晰度存在一定差異。模板DNA用量為10和20ng時(shí)條帶清晰度不佳，30～60ng條帶清晰度稍強(qiáng)且表現(xiàn)一致?？紤]到節(jié)省模板用量，最終選定在25μL反應(yīng)體系中加30ng模板DNA為宜。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析Table 3 Statistic result of the orthogonal design

2.3 反應(yīng)體系的驗(yàn)證及多態(tài)性引物組合的篩選

應(yīng)用上述最佳反應(yīng)體系，隨機(jī)組合了98對SRAP引物組合對3份山野豌豆種源進(jìn)行了SRAP擴(kuò)增（圖2）。結(jié)果表明，1）在篩選的98對引物組合中，94對引物組合擴(kuò)增得到清晰穩(wěn)定的譜帶，占總數(shù)的95.9%，表明該反應(yīng)體系具有較好的穩(wěn)定性；在有擴(kuò)增產(chǎn)物的94對引物組合中有20對引物組合擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，占總數(shù)21.3%。2）98對引物共擴(kuò)增出983條帶，其中20對具有多態(tài)性的引物組合擴(kuò)增出的條帶總數(shù)為164條，占總條帶數(shù)的16.7%，具有多態(tài)性的條帶有30條，平均每對引物組合擴(kuò)增出1.5條。3）不同引物組合檢測到的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)目存在差異，變異幅度為1～7。

3 討論與結(jié)論

3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化SRAP－PCR反應(yīng)體系

PCR擴(kuò)增體系主要影響因素包括 Mg2＋、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶以及模板DNA。本研究優(yōu)化出的體系表明引物濃度對擴(kuò)增結(jié)果影響最大，這與黃春瓊等［28］、周良彬等［29］的結(jié)果不一致，這主要是因?yàn)楸狙芯吭谝锾荻仍O(shè)計(jì)時(shí)加入了以前文獻(xiàn)中不常見到的高濃度——2.0μmol／L，僅在昝逢剛等［30］對荔枝（Litchichinensis）和許永華等［31］對人參（Panaxginseng）的研究中分別出現(xiàn)過5 mmol／L和2.0μmol／L的高引物濃度。雖說文獻(xiàn)中常見引物濃度要以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，但本研究結(jié)果表明高濃度的引物濃度不但沒有引起錯(cuò)配反而得到更清晰的條帶，從圖1可看到7道與9道均得到1kb處的條帶，而9道的引物濃度僅為0.2μmol／L，這說明此帶并非非特異性條帶。此后以6號與14號為DNA模板進(jìn)行的重復(fù)試驗(yàn)，也證實(shí)了2.0μmol／L的引物濃度并無非特異性擴(kuò)增條帶，反而條帶清晰這一論斷。其次，影響較大的是Mg2＋濃度。這與王芳［18］、王俊娥［21］、艾鵬飛等［32］、仲叢來等［33］在大豆、山羊豆、小麥（Triticumaestivum）和麻瘋樹（Jatrophacurcas）上的試驗(yàn)結(jié)果一致，這說明在SRAP－PCR反應(yīng)體系中Mg2＋濃度的影響是很大的，在以后的優(yōu)化試驗(yàn)中要重點(diǎn)關(guān)注。再次，影響因子較小的是Taq DNA聚合酶用量和dNTP濃度，其中不同dNTP濃度的擴(kuò)增效果差異很小。在正交試驗(yàn)之后，本研究又對DNA模板用量進(jìn)行了單因素優(yōu)化。雖然DNA模板用量對擴(kuò)增的影響不大［34，35］，但本研究證實(shí)用量過少會明顯影響條帶的數(shù)量與清晰度，DNA模板用量為10～20ng明顯沒有30～60ng的條帶清晰度高，所以本實(shí)驗(yàn)選擇30ng的DNA模板用量，此結(jié)果與孫佩光等［36］、陳慶榆等［37］的研究結(jié)果一致。

圖2 優(yōu)化的SRAP－PCR反應(yīng)體系在部分引物組合中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Results amplified by optimized system using some primer combinations

3.2 SRAP－PCR反應(yīng)優(yōu)化體系的驗(yàn)證

本研究不僅通過98對引物對優(yōu)化出的SRAP－PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了驗(yàn)證，而且在優(yōu)化過程中選用了3種來自北京、山西、內(nèi)蒙古不同地域的模板DNA取得了二次驗(yàn)證，以此保證了優(yōu)化體系的穩(wěn)定性與良好的適用性。與此同時(shí)，本研究亦篩選出20對多態(tài)性良好的引物，對以后山野豌豆的分子生物學(xué)研究打下了良好的基礎(chǔ)。

3.3 結(jié)論

本研究利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對山野豌豆SRAP－PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，得到的最佳反應(yīng)體系為：2μL 10×PCR buffer（不含 Mg2＋）、30ng的模板 DNA、引物2.0μmol／L、Mg2＋2.0mmol／L、Taq DNA 聚合酶1.5U、dNTP 0.2mmol／L，總體積為25μL。

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