傅廣華，鄧文強(qiáng)，劉 巧，陸予云，李旭文，陳少華，李宏光，王 萌

2.廣州醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣州 510925；

3.從化市中醫(yī)醫(yī)院，廣州 510925

并殖吸蟲（Paragonimus）俗稱肺吸蟲。某些種類可感染人引起人肺吸蟲?。╬aragonimiasis），對(duì)人體健康危害極大。肺吸蟲病是我國(guó)重要的人獸共患食源性寄生蟲病之一。在早期的并殖吸蟲流行病學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，廣東粵北山區(qū)存在并殖吸蟲疫源地，并有衛(wèi)氏并殖吸蟲（Paragonimuswestermani，）、斯氏貍殖吸蟲（Pagumogonimusskrjabini，）感染的病例報(bào)告［1－2］。近年來，傅廣華等人在粵北山區(qū)進(jìn)行了并殖吸蟲疫源地調(diào)查，新發(fā)現(xiàn)報(bào)告衛(wèi)氏并殖吸蟲與三平正并殖吸蟲（Euparagonimuscenocopiosus，）疫源地各1處［3－4］。為了全面了解粵北山區(qū)并殖吸蟲流行分布現(xiàn)狀，并殖吸蟲及第一、二中間宿主的種類，做好應(yīng)對(duì)可能由并殖吸蟲引發(fā)的公共衛(wèi)生安全事件，采用現(xiàn)埸流行病學(xué)調(diào)查與分子生物學(xué)技術(shù)DNA序列分析相結(jié)合進(jìn)行物種鑒定方法，于2008年8月至2011年10月對(duì)粵北韶關(guān)市所轄的樂昌市、南雄市、始興縣、翁源縣、乳源縣、新豐縣、仁化縣及曲江區(qū)等地進(jìn)行并殖吸蟲自然疫源地分布，并殖吸蟲種類及中間宿主種類分布狀況調(diào)查，現(xiàn)將初步研究結(jié)果資料匯總報(bào)告。

1 材料與方法

1.1 第一、二中間宿主采集與檢查 粵北地區(qū)每個(gè)縣、市各選擇3～5個(gè)調(diào)查點(diǎn)，山溪中捕捉螺螄1 000～3 000只、溪蟹30只～100只，按常規(guī)法解剖螺螄、溪蟹，分別檢查并殖吸蟲尾蚴、囊蚴，并作螺螄、溪蟹物種鑒定［5］。

1.2 保蟲宿主糞便收集與檢查 收集調(diào)查地附近村莊村民家中飼養(yǎng)的貓、犬糞便若干份，或調(diào)查地附近野生動(dòng)物山貓糞便若干份。采用沉淀集卵法，取沉渣檢查并殖吸蟲卵。

1.3 人工感染動(dòng)物試驗(yàn) 選擇購(gòu)自并殖吸蟲非流行區(qū)成年家貓、家犬若干只，實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行糞便查找并殖吸蟲卵，結(jié)果陰性雄性貓、犬用作動(dòng)物試驗(yàn)。每只家貓飼喂并殖吸蟲囊蚴50個(gè)，每只家犬飼喂并殖吸蟲囊蚴200個(gè)，飼養(yǎng)100 d后取糞便查找并殖吸蟲卵，剖殺糞便檢查并殖吸蟲卵陽性貓、犬，肺臟內(nèi)查找并殖吸蟲成蟲。

2 結(jié) 果

2.1 第一、二中間宿主檢查結(jié)果 乳源縣、新豐縣、仁化縣各調(diào)查點(diǎn)采集的螺螄、溪蟹樣本均未檢出并殖吸蟲短尾尾蚴及囊蚴。南雄市珠璣鎮(zhèn)里東、叟里元、下洞河3個(gè)調(diào)查點(diǎn)溪蟹檢出三平正并殖吸蟲囊蚴及體外脫囊的后尾蚴，見圖1、2。感染率分別為74.54﹪ （41/53）、68.91﹪ （32/47）、77.77﹪（24/32）。溪蟹經(jīng)福建省疾病預(yù)防控制中心程由注主任鑒定為平和華溪蟹 （Sinopotamonpinheense，），見圖3、4。翁源縣新江鎮(zhèn)太坪調(diào)查點(diǎn)溪蟹檢出三平正并殖吸蟲囊蚴，感染率為76.92﹪ （40/52）。溪蟹物種鑒定為平和華溪蟹。曲江區(qū)小坑調(diào)查點(diǎn)溪蟹也檢出三平正并殖吸蟲囊蚴，感染率為81.5% （22/27）。溪蟹物種鑒定為平和華溪蟹。樂昌市樂城鎮(zhèn)大洞調(diào)查點(diǎn)螺螄檢出并殖吸蟲短尾尾蚴，見圖5。感染率為0.058%（1/1 700），螺螄物種鑒定為放逸短溝蜷（Semisulcospiralibertine，）見圖6。溪蟹檢出衛(wèi)氏并殖吸蟲吸蟲囊蚴及體外脫囊的后尾蚴，見圖7、8。感染率為38.09﹪ （32/84）。感染度：9.16個(gè)囊蚴/只蟹，0.58個(gè)囊蚴/g蟹。溪蟹物種鑒定為平和華溪蟹，見圖3、4。結(jié)果見表1。

2.2 保蟲宿主檢查結(jié)果 對(duì)粵北地區(qū)6個(gè)市、縣調(diào)查點(diǎn)采集的多份貓、犬糞便，采用沉淀集卵法均未檢出并殖吸蟲卵。

2.3 人工感染動(dòng)物試驗(yàn)檢查結(jié)果 取每個(gè)調(diào)查點(diǎn)溪蟹解剖檢獲衛(wèi)氏并殖吸蟲囊蚴或三平正并殖吸蟲囊蚴，各感染貓、犬1條，飼養(yǎng)100 d后分別剖殺查找成蟲。感染衛(wèi)氏并殖吸蟲囊蚴貓肺臟有7個(gè)囊包，共檢獲13條成蟲和大量蟲卵，見圖9。感染衛(wèi)氏并殖吸蟲囊蚴犬肺臟有18個(gè)囊包，共檢獲34條成蟲和大量蟲卵。5條感染不同地點(diǎn)三平正并殖吸蟲囊蚴貓肺臟分別有1～2個(gè)囊包，共檢獲12條成蟲和大量蟲卵，見圖10。5條感染三平正并殖吸蟲囊蚴犬肺臟分別有8～12個(gè)囊包，共檢獲83條成蟲和大量蟲卵。每只人工感染動(dòng)物糞便檢獲蟲卵形態(tài)結(jié)構(gòu)特征與肺部囊包內(nèi)檢獲蟲卵相同。檢獲成蟲蟲體染色后，制成玻片裝大體標(biāo)本，鏡下觀察形態(tài)特征分別符合衛(wèi)氏并殖吸蟲、三平正并殖吸蟲，見圖11、12。

2.4COI、ITS2基因DNA檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 COI與ITS2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 用檢獲粵北地區(qū)新發(fā)現(xiàn)5處三平正并殖吸蟲、1處衛(wèi)氏并殖吸蟲疫源地囊蚴，人工感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所獲成蟲樣品，進(jìn)行COI與ITS2基因PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖13、14。

2.4.2 COI與ITS2基因DNA序列分析測(cè)序結(jié)果人工感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所獲成蟲樣品COI與ITS2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)序列測(cè)序，結(jié)果見圖15－18（為節(jié)約篇幅，P.w與E.c各列1個(gè)COI、ITS2基因序列結(jié)果圖）。將每個(gè)樣本測(cè)得COI與ITS2基因DNA序列與GenBank（美國(guó)國(guó)家生物工程信息中心、國(guó)立醫(yī)學(xué)圖書館、國(guó)立衛(wèi)生院聯(lián)合成立，www.mcbi.nih.gov）檢索三平正并殖吸蟲 COI基因（AF159594.1）、ITS2基因（AF159602.1），衛(wèi)氏并殖 吸 蟲 COI 基 因 （AY140694.1）、ITS2 基 因（AB354217.1）進(jìn)行NCBI Blast序列比對(duì)，里東、叟里元、下洞河、大坪、小坑成蟲樣本COI基因序列與GenBank檢索三平正并殖吸蟲COI基因序列同源性分別為：99.5% （319/320個(gè)堿基）；100% （320/320個(gè)堿 基）；99.5% （329/330 個(gè) 堿 基）；99.5%（299/300個(gè)堿基）；100% （334/334個(gè)堿基），大洞成蟲樣本COI基因序列與GenBank檢索衛(wèi)氏并殖吸蟲COI基因序列同源性100% （334/334個(gè)堿基）。里東、叟里元、下洞河、大坪、小坑成蟲樣本ITS2基因序列與GenBank檢索三平正并殖吸蟲ITS2基因序列同源性分別為：100%（349/340個(gè)堿基）；100% （360/360個(gè)堿基）；100%（360/360個(gè)堿基）；100%（360/360個(gè)堿基）；100% （360/360個(gè)堿基），大洞成蟲樣本ITS2基因序列與GenBank檢索衛(wèi)氏并殖吸蟲ITS2基因序列同源性99.5%（415/420個(gè)堿基）。

表1 不同調(diào)查點(diǎn)樣本檢查結(jié)果Tab.1 Sample test in different survey sites

圖13 COI基因PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果1：里東；2：叟里元；3：下洞河；4：太坪；5：小坑三平正并殖吸蟲；6：大洞衛(wèi)氏并殖吸蟲；M：PCR標(biāo)志物Fig.13 PCR amplification results on electrophoresis of COL gene1：Li dong；2：Souliyuan；3：Xiadonghe；4：Taiping；5：Xiaokeng P.c；6：Dadong P.w；M：PCR marker.

圖14 ITS2基因PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果1：里東；2：叟里元；3：下洞河；4：太坪；5：小坑三平正并殖吸蟲；6：大洞衛(wèi)氏并殖吸蟲；M：PCR標(biāo)志物Fig.14 PCR amplification results on electrophoresis of ITS2 gene1：Li dong；2：Souliyuan；3：Xiadonghe；4：Taiping；5：Xiaokeng P.c；6：Dadong P.w；M：PCR marker.

圖15 三平正并殖吸蟲COI基因序列Fig.15 E.C COI gene sequences

圖16 三平正并殖吸蟲ITS2基因序列Fig.16 E.C ITS2 gene sequences

圖17 衛(wèi)氏并殖吸蟲COI基因序列Fig.17 P.w COI gene sequences

圖18 衛(wèi)氏并殖吸蟲ITS2基因序列Fig.18 P.w ITS2 gene sequences

3 討 論

粵北地區(qū)地處南嶺山脈之南，珠江水系的北江上游。地理位置介于東經(jīng)112°50′～114°45′，北緯23°53′～25°31′。屬南亞熱帶和北亞熱帶過渡帶并以中亞熱帶氣候?yàn)橹鞯臐駶?rùn)性季風(fēng)型氣候，年平均氣溫18～21℃，植物種類繁多，森林覆蓋率高達(dá)76.6%。多數(shù)山溪水流終年不枯。良好的自然生態(tài)環(huán)境，適合于并殖吸蟲第一中間宿主淡水螺類，第二中間宿主溪蟹類，終宿主貓科類動(dòng)物如果子貍、野貓等繁衍生息。為并殖吸蟲的生活史環(huán)節(jié)提供了天然適宜的地理環(huán)境條件。根據(jù)目前已獲得研究結(jié)果顯示，粵北部分山區(qū)乃存在并殖吸蟲自然疫源地。結(jié)果1中南雄、翁源和曲江三個(gè)市、縣5個(gè)調(diào)查點(diǎn)溪蟹體內(nèi)檢獲三平正并殖吸蟲囊蚴，樂昌市1調(diào)查點(diǎn)螺螄體內(nèi)檢獲并殖吸蟲短尾尾蚴，溪蟹體內(nèi)檢獲衛(wèi)氏并殖吸蟲囊蚴。依據(jù)幼蟲尾蚴、囊蚴，人工動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)檢獲成蟲及蟲卵的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征鑒定，成蟲樣本的DNA測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析聯(lián)合鑒定，本項(xiàng)研究在粵北四市、縣山區(qū)新發(fā)現(xiàn)三平正并殖吸蟲自然疫源地5處，衛(wèi)氏并殖吸蟲自然疫源地1處。從5處三平正并殖吸蟲疫源地采集的放逸短溝蜷中均未檢出短尾尾蚴。自1962年陳心陶首次發(fā)現(xiàn)三平正并殖吸蟲至今已40余年，眾多的研究者為揭開三平正并殖吸蟲第一中間宿主之迷進(jìn)行了大量的研究工作，至今未果［3］。本項(xiàng)研究中5處新發(fā)現(xiàn)三平正并殖吸蟲第一中間宿主暫時(shí)也是一個(gè)未知之迷。而新發(fā)現(xiàn)衛(wèi)氏并殖吸蟲疫源地的第一中間宿則為放逸短溝蜷。值得注意的是，本項(xiàng)研究新發(fā)現(xiàn)的所有三平正并殖蟲與衛(wèi)氏并殖吸蟲疫源地第二中間宿主淡水蟹種，均為平和華溪蟹。與陸予云等近年在廣東省新發(fā)現(xiàn)多處衛(wèi)氏并殖吸蟲和三平正并殖吸蟲疫源地第二中間宿主相同，提示在粵北乃至廣東省平和華溪蟹是一個(gè)淡水蟹優(yōu)勢(shì)種，也是廣東省并殖吸蟲的主要第二中間宿主。根據(jù)樊培方（1980）提出：以第二中間宿主囊蚴感染率及感染程度計(jì)算感染指數(shù)來劃分疫區(qū)等級(jí)［10］，南雄市里東、叟里元、下洞河3個(gè)調(diào)查點(diǎn)溪蟹三平正并殖吸蟲囊蚴感染指數(shù)分別為1.70、1.67、1.83，翁源縣大坪調(diào)查點(diǎn)為1.84，曲江縣小坑調(diào)查點(diǎn)為1.92。樂昌市大洞調(diào)查點(diǎn)溪蟹衛(wèi)氏并殖吸蟲囊蚴感染指數(shù)為1.92。各調(diào)查點(diǎn)囊蚴感染指數(shù)均在1～99之間。因此，本項(xiàng)研究至今在粵北四市、縣山區(qū)新發(fā)現(xiàn)三平正并殖吸蟲與衛(wèi)氏并殖吸蟲自然疫源地均為高度疫源地（II級(jí)）。鑒于衛(wèi)氏并殖吸蟲是我國(guó)主要致病肺吸蟲蟲種，應(yīng)做好疫源地人群中可能發(fā)生的并殖吸蟲感染防制措施，防止可能由此引發(fā)的公共衛(wèi)生安全問題，保障疫源地人群身體健康。DNA測(cè)序研究結(jié)果顯示：5處三平正并殖吸蟲樣本COI基因序列與GenBank檢索基因（AF159594.1）同源性分別為99.5%～100%之間。ITS2基因序列與檢索基因（AF159602.1）同源性均為100%。衛(wèi)氏并殖吸蟲樣本COI基因序列與GenBank檢索基因（AY140694.1）同源性為100% 。ITS2基因序列與檢索基因（AB354217.1）同源性均為99.5% 。迄今為止，檢測(cè)生物種DNA序列在親緣關(guān)系及物種分類鑒定上均具有重要價(jià)值。目前公認(rèn)，并殖吸蟲COI基因適用于種遺傳差異的研究，ITS2基因適用于并殖吸蟲種間差異的研究［11］。結(jié)合本項(xiàng)研究中上述各樣本DNA測(cè)序比對(duì)結(jié)果分析，粵北四市、縣山區(qū)新發(fā)現(xiàn)5處三平正并殖吸蟲自然疫源地蟲種之間親緣性無差異性，并且與GenBank檢索基因也無明顯差異性。衛(wèi)氏并殖吸蟲自然疫源地蟲種與GenBank檢索基因親緣性無明顯差異性。

本項(xiàng)研究中溪蟹物種鑒定得到福建省疾病預(yù)防控制中心程由注主任幫助，在此表示感謝！

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