肖衛(wèi)榮 ，袁照清 ，余玉珍 ，徐良全 ，鄒文斌

（1.豐城市婦幼保健醫(yī)院婦產(chǎn)科，江西 豐城 331100；2.萬載縣中醫(yī)院婦產(chǎn)科，江西 萬載 336100；3.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)部，南昌 330006；4.豐城市人民醫(yī)院醫(yī)務(wù)科，江西 豐城331100）

卵巢儲(chǔ)備功能是指卵巢內(nèi)存留卵泡的數(shù)量和質(zhì)量，能反映女性的生育潛能和生殖內(nèi)分泌功能。卵巢儲(chǔ)備功能下降（decreasing ovarian store，DOS），可導(dǎo)致女性生育能力減弱及性激素缺乏，進(jìn)一步發(fā)展為卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）。近年來，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)、文化、生活環(huán)境、工作節(jié)奏等的改變，DOS發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響著女性的生殖健康和生活質(zhì)量。以往研究[1-2]表明，應(yīng)激可以通過影響內(nèi)分泌從而影響生殖功能。至于長期心理應(yīng)激條件下，是否會(huì)導(dǎo)致卵泡細(xì)胞的氧化損傷，國內(nèi)外均未見報(bào)道。本研究通過建立動(dòng)物的應(yīng)激模型，并進(jìn)行大豆異黃酮（soy isoflavones，SI）干預(yù)處理。同時(shí)，通過測定小鼠卵巢中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物（glutathione peroxi-dase，GSH-Px）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的變化，探究心理應(yīng)激對(duì)卵巢氧化損傷作用及其損傷機(jī)制，明確心理問題對(duì)女性生殖健康的影響，為婦女更年期的推遲及卵巢早衰的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取剛剛性成熟的健康雌性昆明小鼠50只，體質(zhì)量18～22 g，由南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。喂養(yǎng)普通飼料，自由飲水。動(dòng)物房溫度控制在（24±1）℃，濕度為 40%～70%，光∶暗周期為 12 h∶12 h。適應(yīng)喂養(yǎng)3 d后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：對(duì)照組、應(yīng)激模型組、SI低劑量組 （83 mg·kg-1）、SI中劑量組（167 mg·kg-1）和 SI高劑量組（333 mg·kg-1），每組 10 只小鼠。SI組應(yīng)激的同時(shí)給與SI處理。SI各組每日按2%（即 2 mL·100 g-1）給予相應(yīng)劑量的 SI，用 0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配制成混懸液灌胃；應(yīng)激模型組和對(duì)照組每日給予等體積0.5%CMC-Na溶液灌胃。連續(xù)30 d。

1.2 心理應(yīng)激動(dòng)物模型的建立

參照文獻(xiàn)[3]的方法，SI組及應(yīng)激模型組小鼠以束縛為應(yīng)激原建立心理應(yīng)激動(dòng)物模型。使用50 mL離心管（圖1），在離心管管壁前端扎數(shù)個(gè)孔，保證空氣通暢。在離心管蓋子上鉆孔，待小鼠鉆入離心管后，蓋上離心管蓋子，將小鼠尾部暴露在外面，封閉后的離心管固定于水平桌面上。每天09:00開始，15:00解除，束縛持續(xù)30 d。

1.3 檢測指標(biāo)及方法

圖1 束縛應(yīng)激模型

1.3.1 血清皮質(zhì)醇測定

在末次束縛應(yīng)激24 h后，取小鼠眼眶血分離血清，采用皮質(zhì)醇放射免疫分析測定盒（北京四環(huán)生物技術(shù)有限公司）檢測血清中的皮質(zhì)醇含量。

1.3.2 SOD、GSH-Px活性和 MDA含量測定

分別摘取各組小鼠卵巢。稱重后，按1∶9的比例與冷生理鹽水混合，制成10%的勻漿。離心后，取上清液，按試劑盒（南京建成生物工程研究所)要求測定SOD、GSH-Px活性及MDA含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清皮質(zhì)醇分泌的變化

應(yīng)激模型組及SI低劑量組皮質(zhì)醇水平明顯高于對(duì)照組（均P＜0.05)；與對(duì)照組相比，SI中高劑量組皮質(zhì)醇雖然有升高，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），SI各劑量組血清皮質(zhì)醇較應(yīng)激模型組低（P＜0.05），其中SI中劑量皮質(zhì)醇水平降低最明顯。見表1。

2.2 各組小鼠卵巢SOD、GSH-Px活性及MDA含量的變化

各應(yīng)激組小鼠卵巢組織中SOD、GSH-Px活力均低于對(duì)照組，MDA含量均高于對(duì)照組（均P＜0.05）；與應(yīng)激模型組相比，SI各劑量組小鼠卵巢組織中SOD、GSH-Px 活力均明顯升高（均 P＜0.05），MDA 含量均明顯降低（均P＜0.05），其中以SI中劑量組效果最為明顯。見表1。

表1 各組小鼠血清皮質(zhì)醇水平及卵巢SOD、GSH-Px活性和 MDA含量的變化 ±s

表1 各組小鼠血清皮質(zhì)醇水平及卵巢SOD、GSH-Px活性和 MDA含量的變化 ±s

*P＜0.05與對(duì)照組比較，△P＜0.05與應(yīng)激模型組比較，#P＜0.05與SI中劑量組比較。

MDA/（nmol·mgprot-1）對(duì)照組 10 257.26±1.51 175.86±13.51 126.86±8.65 0.356±0.05應(yīng)激模型組 10 275.86±1.21* 136.43±12.21* 78.24±12.15* 0.615±0.03*SI低劑量組 10 270.16±1.21*△ 148.79±15.21*△# 89.02±6.82*△# 0.515±0.08*△#SI中劑量組 10 259.47±1.48△ 169.56±10.23*△ 115.35±8.65*△ 0.337±0.12*△SI高劑量組 10 263.02±1.23△ 156.14±15.48*△# 94.36±8.65*△# 0.428±0.13*△#組別 n 血清皮質(zhì)醇ρ/（ng·mL-1）SOD/（NU·mgprot-1）GSH-Px/（活力單位·mgprot-1）

3 討論

心理社會(huì)因素是現(xiàn)代社會(huì)中重要的應(yīng)激源。長期應(yīng)激時(shí)，下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）持續(xù)激活，皮質(zhì)醇大量釋放。同時(shí)，交感神經(jīng)系統(tǒng)（SNS）興奮，交感神經(jīng)末梢和腎上腺髓質(zhì)釋放兒茶酚胺增加，導(dǎo)致機(jī)體的穩(wěn)態(tài)失衡。另外，應(yīng)激條件下產(chǎn)生的許多活性氧和自由基，對(duì)組織細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的氧化應(yīng)激損傷。

氧自由基，統(tǒng)稱為活性氧（reactive oxygen species，ROS）。ROS是需氧生物在自身的新陳代謝過程中，由于受到內(nèi)外環(huán)境的刺激而在其機(jī)體內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生的活性產(chǎn)物，包括超氧陰離子（O2-·）、羥自由基（OH·）、氫過氧化物（H2O2）及單線態(tài)氧等。 ROS 因含有未成對(duì)電子,所以極不穩(wěn)定,容易與其鄰近分子反應(yīng)，并可誘發(fā)產(chǎn)生新的自由基，一般情況下可以參與機(jī)體的物質(zhì)代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)細(xì)胞的正常代謝起著重要作用。ROS的產(chǎn)生會(huì)受到體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，從而保持在平衡的健康狀態(tài)。當(dāng)自由基產(chǎn)生過多或自由基通過內(nèi)源性的抗氧化成分進(jìn)行清除減少，如SOD和GSH-Px等出現(xiàn)故障，體內(nèi)氧自由基代謝就會(huì)出現(xiàn)失衡，導(dǎo)致自由基蓄積過多，攻擊機(jī)體，則對(duì)組織細(xì)胞產(chǎn)生不可逆損傷，氧化應(yīng)激即發(fā)生,造成蛋白質(zhì)損傷、脂質(zhì)過氧化、DNA改變、酶失活等,發(fā)生包括癌癥、心血管疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、感染等多種病變[4-5]。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，心理應(yīng)激可以導(dǎo)致卵巢儲(chǔ)備功能下降[6]，其可能的機(jī)制是否與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)呢？本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了筆者的設(shè)想，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)各應(yīng)激組小鼠卵巢組織中SOD、GSH-Px活力均較對(duì)照組明顯偏低，MDA含量較對(duì)照組明顯升高，說明應(yīng)激可以導(dǎo)致小鼠卵巢的氧化損傷。

SI是從大豆中分離提取的一類多酚化合物，具有防癌、抗衰老、抗氧化、防治骨質(zhì)疏松、調(diào)節(jié)細(xì)胞的基因表達(dá)及抑制細(xì)胞凋亡等作用[7-11]，主要包括大豆黃酮、大豆黃酮甙、染料木素和染料木甙。SI與內(nèi)源性雌激素有相似的分子結(jié)構(gòu),能與雌激素α、β 2 種受體（Erα、Erβ）結(jié)合，發(fā)揮雌激素樣作用[12]。 本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激的同時(shí)給予SI干預(yù)，其血清皮質(zhì)醇水平明顯降低，其機(jī)制就是SI具有擬雌激素的作用，通過直接或間接影響HPA功能，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，從而抑制皮質(zhì)醇的釋放。另外，SI的各主要成分均是天然抗氧化劑，能刺激抗氧化酶合成并增加其活性。同時(shí)，清除體內(nèi)活性氧自由基、減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)[13-15]均表明，SI能夠通過直接清除活性氧和間接的抗氧化作用使心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中的MDA含量降低。J.S.Lee[16]發(fā)現(xiàn)，染料木黃酮可以顯著提高糖尿病大鼠肝臟抗氧化酶包括SOD、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性。C.Borras等[17]用染料木黃酮孵育人乳腺瘤細(xì)胞系（MCF-7）48 h，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞的 Mn SOD mRNA 含量顯著增高。SOD的唯一生理功能是歧化 O2-·，它可以促進(jìn) O2-·的歧化反應(yīng)，清除O2-·的毒性作用，減輕和防止脂質(zhì)過氧化作用，SOD活性增強(qiáng)可以保護(hù)細(xì)胞不受自由基的損害。本研究發(fā)現(xiàn)：與應(yīng)激模型組相比，SI各亞組小鼠卵巢組織中SOD、GSH-Px活力均明顯升高，MDA含量均明顯降低。表明SI可以對(duì)抗或降低應(yīng)激所致的小鼠卵巢的氧化損傷。

總之，SI所具有的抗氧化作用能淬滅體內(nèi)異常增多的自由基、減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物、增加抗氧化酶的活性，具有很好的開發(fā)價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)系在南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院生殖研究所內(nèi)完成，并得到南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院徐良金老師的大力指導(dǎo)，在此表示感謝！

[1] 連曉媛,丁巖,張均田.應(yīng)激性生殖內(nèi)分泌功能低下動(dòng)物模型[J].中國新藥雜志,1999,8（10）:673-675.

[2] 程湘,徐輝,艾國平,等.慢性情緒應(yīng)激對(duì)大鼠卵巢功能影響的初步觀察[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，29（14）:1368-1370.

[3] Karp J D,Smith J,Hawk K,et al.Restraint stress augments antibody production in cyclophosphamide-treatedmice[J].Physicol Behav,2000,70（3/4）:271-278.

[4] Papaharalambus C A，Griendling K K.Basicmechanisms of oxidative stress and reactive oxygen species in cardiovascular injury[J].Trends Cardiovasc Med，2007，17（2）：48-54.

[5] Wadsworth R M.Oxidative stress and the endothelium[J].Exp Physiol，2008，93（1）：155-157.

[6] 姚懿，姚琴琴，潘小玲，等.心理應(yīng)激與卵巢儲(chǔ)備功能下降的相關(guān)性研究[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012,52（3）：11-15.

[7] Ibrahim W H,Habib H M,Chow C K,et al.Isoflavone-rich soy isolate reduces lipid peroxidation in mouse liver[J].Int J Vitam Nutr Res,2008,78（4/5）:217-222.

[8] Di Giacomo C,Acquaviva R,Sorrenti V,et al.Oxidative and antioxidant status in plasma of runners:effect of oral supplementation with natural antioxidants[J].Med Food，2009,12（1）:145-150.

[9] Sehmisch S,Hammer F,Christoffel J,et al.Comparison of the phytohormones genistein,resveratrol and 8-prenylnaringenin as agents for preventing osteoporosis[J].Planta Med,2008,74（8）:794-801.

[10] Grainger E M,Schwartz S J,Wang S,et al.A combination of tomato and soy products for men with recurring prostate cancer and rising prostate specific antigen [J].Nutr Cancer,2008,60（2）:145-154.

[11] Si H,Liu D.Genistein,a soy phytoestrogen,upregulates the expression ofhuman endothelialnitric oxide synthase and lowers blood pressure in spontaneously hypertensive rats[J].Nutr,2008,138（2）:297-304.

[12] Tikkanen M J，Adlercreutz H.Dietary soy-derived isoflavone phytoestrogens.Could they have a role in coronary heart disease prevention[J].Biochem Pharmacol，2000,60（1）:1-5.

[13] Park E，Shin J I，Park O J，et al.Soy isoflavone supplementation alleviates oxidative stress and improves systolic blood pressure in male spontaneously hypertensive rats[J].Nutr Sci Vitaminol,2005,51（4）:254－259.

[14] Miller E,Malinowsk K,Gatecka E,et al.Role of flavonoids as antioxidants in human organism[J].Pol Merkur Lekarski，2008，24（144）:556-560.

[15] Chung M J，Kang A Y，Lee K M，et al.Water-soluble genistin glycoside isoflavones up-regulate antioxidant metallothionein expression and scavenge free radicals[J].J Agric Food Chem,2006,54（11）:3819-3826.

[16] Lee J S.Effects of soy protein and genistein on blood glucose,antioxidant enzyme activities,and lipid profile in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Life Sci,2006,79（16）:1578-1584.

[17] Borras C,Gambini J,Gomez Cabrera M C,et al.Genistein,a soy isoflavone,up-regulates expression of antioxidant genes:involvement of estrogen receptors,ERK1/2,and NF kappaB[J].FASEB J，2006，20（12）:2136-2138.