王永，陳曉鵬，2

(1.南京市浦口區(qū)中醫(yī)院普外科，江蘇 南京 211800;2.皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院肝膽外科，安徽蕪湖 241000)

乙酰肝素酶(heparanase，HPSE)是一種與腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成等多種病理生理過程密切相關(guān)的細胞基質(zhì)中硫酸乙酰肝素蛋白多糖的降解酶［1］。HPSE在大部分腫瘤細胞中呈高表達，在正常的體細胞中不表達。研究發(fā)現(xiàn)，利用腫瘤特異性啟動子驅(qū)動或效應(yīng)基因能進行腫瘤靶向治療，如甲胎蛋白啟動子、癌胚抗原啟動子及前列腺膜相關(guān)抗原啟動子等。但上述啟動子只針對特定腫瘤，屬于窄譜腫瘤特異性啟動子。HPSE基因啟動子是最近發(fā)現(xiàn)并被證實的具有較廣譜腫瘤特異性的啟動子，是腫瘤靶向治療較為理想的驅(qū)動工具，但是目前實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)其驅(qū)動基因表達的活性不高［2］，因此，改造HPSE啟動子以提高其驅(qū)動基因的表達活性是一個重要的研究方向。本實驗初步嘗試以增強子序列［3］修飾HPSE啟動子，轉(zhuǎn)染腫瘤細胞并分析其活性，為提高HPSE啟動子的驅(qū)動活性提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑和儀器

人肝癌細胞(HepG2)、喉癌上皮細胞(Hep-2)、人慢性髄原白血病細胞(K-562)均為合肥一力公司產(chǎn)品;質(zhì)粒pEGFP-HPSEp由皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院中心藥理實驗室提供，為前期實驗構(gòu)建并保存于－80℃超低溫冰箱;含SV40增強子的載體pGL3-Control Vector和陽性對照質(zhì)粒 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR為上海生物工程公司產(chǎn)品;PFX、T4 DNA ligase、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ、XhoⅠ和HindⅢ為 MBI公司產(chǎn)品;PCR純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒和小量質(zhì)粒提取試劑盒均為北京道普公司產(chǎn)品;DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、dNTP、PCR Buffers 均為Takara公司產(chǎn)品;瓊脂糖、胰蛋白胨和酵母提取物為英國Oxoid公司產(chǎn)品;10%胎牛血清、Lipofectamine 2000、DMEM培養(yǎng)基和RPIM-1640培養(yǎng)基為Invitrogen公司產(chǎn)品;SV40增強子上、下游引物由中國科學(xué)院上海生物工程有限公司合成;大腸桿菌菌株DH5α由安徽醫(yī)科大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室汪學(xué)龍教授惠贈;熒光顯微鏡(Nikon公司產(chǎn)品);流式細胞儀(Beckman公司產(chǎn)品)。

1.2 SV40增強子的引物設(shè)計

根據(jù)GeneBank中SV40增強子(Accession U47296 pGL3-Control)的核酸序列和PCR引物設(shè)計的原則，用Primer5軟件，設(shè)計SV40增強子的上、下游引物。它們分別是:上游引物Primer1:SV40-F 5'ATATGCgaattcCGA TGGAGCGGAGAATGGG 3'，下游引物 Primer2:SV40-R 5'GCATGTgtcgacGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGG 3'，并在上、下游引物的5'端分別引入限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ的酶切位點(小寫部分為酶切位點，斜體為保護堿基)。

1.3 SV40增強子PCR擴增與純化

采用50 μl PCR反應(yīng)體系。以1 μl含SV40增強子的 pGL3-enhancer DNA 為模板，PFX(5 U·μl－1，Invitrogen)聚合酶0.2 μl，上、下游引物(10 μmol·L－1)各 1 μl，dNTPs(10 mmol·L－1)1 μl，10 × PCR Buffer(含Mg2+)為5 μl。冰上加樣，離心，置 Techgen PCR 儀。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s，57℃ 50 s，72℃ 50 s，共35個循環(huán);最后68℃延伸10 min。用PCR純化回收試劑盒將PCR產(chǎn)物分離純化，操作按試劑盒說明書進行。

1.4 SV40增強子的鑒定和序列分析

制備1%瓊脂糖凝膠后，取PCR產(chǎn)物8 μl與10×Loading Buffer 2 μl混勻上樣，用 DL Marker 2000 為電泳的標(biāo)準(zhǔn)參照物，90 V×400 mA電泳35 min后，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并照相。PCR產(chǎn)物連接T載體，將連接產(chǎn)物用CaCl2法制備的感受態(tài)細胞DH5α 150 μl涂布LB/Kana平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日觀察菌落生長情況，平板膠膜封口，4℃保存。挑取陽性菌落PCR電泳鑒定。經(jīng)鑒定的陽性質(zhì)粒送上海生物技術(shù)公司測序。

1.5 構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-HPSEp-SV40enh

以含有EcoRⅠ和SalⅠ的雙酶切體系分別酶切質(zhì)粒pEGFP-HPSEp及 PCR克隆產(chǎn)物 SV40增強子。30 μl酶切反應(yīng)體系如下:質(zhì)粒pEGFP-HPSEp或PCR克隆產(chǎn)物 15 μl，10 × Buffer 3 μl，ddH2O 10 μl，EcoRⅠ和SalⅠ各1 μl。37℃水浴8 h后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察分析酶切結(jié)果，將酶切產(chǎn)物用膠回收方法回收DNA片段。將膠回收的SV40增強子片段和pEGFP-HPSEp的大片段在T4 DNA連接酶的作用下進行連接。20 μl連接反應(yīng)體系如下:ddH2O 7.5 μl，PCR 膠回收產(chǎn)物7.5 μl，質(zhì)粒 pEGFP-HPSEp 雙酶切產(chǎn)物 2.5 μl，10 × Buffer 2.0 μl，T4 ligase 0.5 μl?；靹蚍磻?yīng)體系，4℃連接過夜。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:10 μl連接反應(yīng)物加120 μl DH5α感受態(tài)細胞，冰上30 min;42℃90 s(熱休克)，立即冰上1～2 min;加400 μl LB 液體培養(yǎng)基，37℃緩慢(150 r·min－1)振蕩45 min;4℃12 000 r·min－1離心 2 min，棄上清，留150 μl涂布 LB/Kana平板;37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，觀察菌落生長情況，平板膠膜封口，4℃保存。挑取陽性菌落進行接種，第2天抽提質(zhì)粒并加以BamHⅠ單酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后送至上海生物有限技術(shù)公司進行DNA序列測定。

1.6 重組質(zhì)粒載體pEGFP-HPSEp-SV40enh的真核表達與功能鑒定

HepG2、Hep2和K562細胞用含10%胎牛血清的RPIM-1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱飽和濕度條件下培養(yǎng)至70%～80%融合時進行轉(zhuǎn)染。每孔細胞接種3孔，分別轉(zhuǎn)染3種質(zhì)粒，即 pEGFP-HPSEp-SV40enh、pEGFP-HPSEp 和陽性對照 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR，按照Lipofectamine 2000說明書進行。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集懸浮細胞，如有貼壁則用0.2%胰酶消化，用含血清的培養(yǎng)基終止消化。每份樣品細胞數(shù)為5×105～1×106個。熒光顯微鏡觀察熒光強度;流式細胞儀檢測表達EGFP的發(fā)光細胞百分比以確定轉(zhuǎn)染效率(轉(zhuǎn)染率比值=pEGFP-HPSEp轉(zhuǎn)染率/pEGFP-HPSEp-SV40enh轉(zhuǎn)染率)。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 SV40增強子PCR擴增

取PCR反應(yīng)液8 μl，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察發(fā)現(xiàn)，在250 bp和500 bp之間出現(xiàn)一特異條帶，大小與理論長度261 bp相符，包括酶切位點和保護堿基24 bp(圖1)。陽性菌落PCR鑒定SV40增強子電泳圖也顯示特異條帶位于250 bp和500 bp之間(圖2)。

圖1 PCR產(chǎn)物的電泳圖Fig 1 Electrophoretogram of PCR product

圖2 陽性菌落PCR產(chǎn)物電泳鑒定Fig 2 Electrophoretogram of positive bacterial colony PCR product

2.2 SV40增強子的測序鑒定

經(jīng)鑒定的陽性質(zhì)粒送上海生物技術(shù)公司測序，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)的SV40增強子核酸序列(Accession U47296 pGL3-Control)237 bp比對完全一致，未發(fā)現(xiàn)堿基插入、缺失和替換等突變。序列包含了完整的SV40增強子序列。比對一致的序列是46～282 bp(237 bp)。40～45 bp GAATTC是EcoRⅠ酶切位點，283～288 bp GTCGAC是SalⅠ酶切位點(圖3)。

2.3 EcoRⅠ和 SalⅠ雙酶切

30 μl酶切反應(yīng)體系中，EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切SV40增強子、質(zhì)粒pEGFP-HPSEp，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，各片段酶切14 bp，大片段原為4 673 bp，小片段原為261 bp(圖4)。

圖3 SV40增強子PCR產(chǎn)物測序的部分截圖Fig 3 Partial graph of reverse sequencing of pEGFP-HPSEp-SV40 enh

圖4 EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切SV40增強子及pEGFP-HPSEpFig 4 Restriction analysis of SV40 enhancer and pEGFPHPSEp cutted by enzymes EcoRⅠ and SalⅠ

2.4 重組質(zhì)粒pEGFP-HPSEp-SV40enh單酶切鑒定

SV40增強子序列插入到質(zhì)粒pEGFP-HPSEp指定克隆位點后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂布LB/Kana平板，挑取陽性菌落進行接種，抽提質(zhì)粒并加以BamHⅠ單酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(圖5)。

2.5 重組質(zhì)粒pEGFP-HPSEp-SV40enh的測序鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證后送至上海生物有限技術(shù)公司進行DNA序列測定(反向測序)，經(jīng)Chromas Lite軟件處理后見互補序列中包含完整的237 bp SV40增強子序列，即原圖65～301 bp處。59～64 bp處為SalⅠ酶切位點，302～307 bp處為EcoRⅠ酶切位點，309～314 bp處為HindⅢ酶切位點，自315 bp后為原載體中HPSE啟動子序列。重組質(zhì)粒構(gòu)建是成功的，SV40增強子序列正確的插入到質(zhì)粒pEGFP-HPSEp中HPSE啟動子的下游(圖6)。

圖5 BamHⅠ單酶切鑒定pEGFP-HPSEp-SV40enhFig 5 Restriction analysis of pEGFP-HPSEp-SV40enh cutted by enzyme BamHⅠ

Chromas Lite軟件處理后互補序列:AAGGGCGCTG GGGCTCGGCGGGAGGAAGTGCTAGAGCTCTTGACTCT CCGCTGCGCGGCAGCTGGCGGGGGGAGCAGCCAGGTG AGCCCaagcttCgaattcCGATGGAGCGGAGAATGGGCGGA ACTGGGCGGAGTTAGGGGCGGGATGGGCGGAGTTAGG GGCGGGACTATGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGC TTTGCATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTT CCACACCTGGTTGCTGACTAATTGAGATGCATGCTTTG CATACTTCTGCCTGCTGGGGAGCCTGGGGACTTTCCAC ACCCTAACTGACACACATTCCACAGCgtcgacGGTACCG CGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCA AGGGCGAGGAGCGT

圖6 重組質(zhì)粒pEGFP-HPSEp-SV40enh中部分片段測序圖(反向測序)Fig 6 Partial graph of sequencing of pEGFP-HPSEp-SV40enh

大寫字母下劃線為插入的SV40增強子序列，gtcgac為SalⅠ酶切位點，gaattc為EcoRⅠ酶切位點，aagctt為HindⅢ酶切位點，HindⅢ酶切位點之前為HPSE啟動子序列。

2.6 重組質(zhì)粒pEGFP-HPSEp-SV40enh在人腫瘤細胞中的促轉(zhuǎn)錄活性

熒光顯微鏡觀察顯示，重組質(zhì)粒pEGFP-HPSEp-SV40enh在人腫瘤細胞株HepG2、Hep2和K562中均表達較強的熒光，與陽性對照質(zhì)粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR轉(zhuǎn)染熒光強度相似，兩者鏡下無明顯差異。而質(zhì)粒pEGFP-HPSEp轉(zhuǎn)染熒光強度較弱，與前兩者相比鏡下差異明顯(圖7)。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，質(zhì)粒pEGFP-HPSEp轉(zhuǎn)染后，發(fā)光細胞所占的百分比由 HepG2(3.7%)、Hep2(6.0%)、K562(5.5%)逐漸減小，重組質(zhì)粒pEGFP-HPSEp-SV40enh轉(zhuǎn)染后發(fā)光細胞所占的百分比也由 HepG2(4.8%)、Hep2(13.4%)、K562(7.7%)逐漸遞減，但均明顯高于前者相應(yīng)細胞株;陽性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染各腫瘤細胞株后發(fā)光細胞百分比與重組質(zhì)粒相比差異不明顯。兩種載體在上述細胞中的轉(zhuǎn)染率比值，即啟動子的相對活性比HPSEp/HPSEp-SV40enh 分別為 HepG2 0.77、Hep2 0.45 和 K562 0.71，均小于1。

3 討 論

腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與HPSE密切相關(guān)。研究證實，HPSE啟動子具有較高而且廣譜的腫瘤組織特異性，在人類乳腺、結(jié)腸、肺、前列腺、卵巢、胰腺、肝臟、胃、皮膚、膀胱等組織源性的腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶中都有高表達活性。HPSE啟動子活性的高低還與腫瘤組織的分化、進展密切相關(guān)，如隨著結(jié)腸癌從不典型增生到高分化、低分化，HPSE啟動子的活性逐漸增加。該啟動子是迄今為止發(fā)現(xiàn)的一種比較理想的既有腫瘤特異性又有腫瘤廣譜性的潛在腫瘤基因靶向治療的新工具［4］。前期實驗正確克隆了HPSE啟動子序列，并成功構(gòu)建了由該啟動子驅(qū)動的表達增強型綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pEGFP-HPSEp，分別轉(zhuǎn)染腫瘤細胞株和正常細胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒pEGFP-HPSEp只在腫瘤細胞株中表達，也說明HPSE啟動子具有腫瘤細胞特異性，但熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測結(jié)果分析表明，HPSE啟動子驅(qū)動基因表達的活性還不夠強，相比較不如巨細胞病毒啟動子的活性［2，5］。

圖7 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA、pEGFP-HPSEp和pEGFP-HPSEp-SV40enh細胞中綠色熒光蛋白表達情況Fig 7 Green fluorescence protein(EGFP)expression of pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA，pEGFP-HPSEp and pEGFP-HPSEp-SV40enh in various kinds of cells

增強子是能使基因轉(zhuǎn)錄速率顯著提高的一類順式作用元件，它能通過啟動子，提高同一條DNA鏈上靶基因轉(zhuǎn)錄的速率，而且對同源或異源基因同樣有效。增強子可在基因的5'上游、基因內(nèi)或3'下游序列中，甚至遠離轉(zhuǎn)錄起始點起作用［6］。SV40增強子是最早發(fā)現(xiàn)的功能強大的病毒增強子，核心序列由72 bp堿基對重復(fù)序列組成。它無明顯的細胞種族偏向性，可以提高很多宿主細胞的基因表達水平;在不同的宿主細胞中，它可以增強表達2～20倍。其調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄激活的機制是Z-DNA結(jié)構(gòu):重復(fù)序列中的5'-GCATGCAT-3'順序，具有嘌呤與嘧啶交替出現(xiàn)的特征，可形成正旋DNA結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)有利于與特定蛋白結(jié)合，促進轉(zhuǎn)錄。SV40增強子不僅能夠增強啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，而且能夠促進質(zhì)粒載體從細胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞核中即具有增強DNA的細胞核定位的功能，這種作用是序列特異性的。因此，用SV40增強子構(gòu)建腫瘤特異性啟動子調(diào)控轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)可以從兩方面增強治療基因的表達水平，可以極大提高轉(zhuǎn)染效率。已有以SV40增強子修飾人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子并提高其轉(zhuǎn)錄活性的成功實驗報道［7-8］。

我們以含SV40增強子的pGL3系列質(zhì)粒為模版設(shè)計引物，上游引物添加EcoRⅠ酶切位點，下游引物添加SalⅠ酶切位點，PCR擴增獲得SV40增強子序列。電泳見PCR產(chǎn)物與理論長度261 bp(237 bp加上酶切位點和保護堿基24 bp)一致，初步證明擴增的SV40增強子序列是正確的?？寺V40增強子的陽性質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和測序，并將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫Accession U47296中的SV40增強子比較，未發(fā)現(xiàn)堿基插入、缺失和替換等突變，與預(yù)期結(jié)果完全一致，進一步證明本研究成功地擴增了一段長為237 bp的SV40增強子。以EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物SV40增強子及pEGFP-HPSEp載體，電泳見大片段為4 659 bp，小片段為247 bp(各片段酶切14 bp，大片段原為4 673 bp，小片段原為261 bp)，與預(yù)期結(jié)果吻合，酶切是成功的。膠回收后以T4 DNA連接酶連接上述兩酶切產(chǎn)物，將 SV40增強子序列插入到 pEGFP-HPSEp序列中HPSE啟動子的下游構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-HPSEp-SV40enh，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性菌落提取質(zhì)粒，用BamHⅠ單酶切重組質(zhì)粒后電泳顯示有4.37 kb和624 bp兩個片段，與預(yù)期吻合，初步證明構(gòu)建成功。測序結(jié)果見完整的SV40增強子片段237 bp成功的插入到pEGFP-HPSEp載體的指定多克隆位點，位于HPSE啟動子序列的下游SalⅠ酶切位點和EcoRⅠ酶切位點之間，而且整個SV40增強子片段中沒有發(fā)生堿基插入、缺失和替換等突變，也未影響載體本身的堿基序列。測序結(jié)果進一步證明了我們構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-HPSEp-SV40enh是成功的，符合增強子修飾啟動子的構(gòu)建原則。酶切鑒定后的重組質(zhì)粒與原質(zhì)粒pEGFP-HPSEp及陽性對照質(zhì)粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR用脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染 HepG2、Hep2和K562細胞，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)pEGFPHPSEp-SV40enh在人腫瘤細胞株HepG2、Hep-2和K-562中均表達較強的熒光，與陽性對照質(zhì)粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR轉(zhuǎn)染熒光強度相似，兩者鏡下無明顯差異。而原質(zhì)粒pEGFP-HPSEp轉(zhuǎn)染熒光強度較弱，與前兩者相比鏡下差異明顯。觀察結(jié)果初步說明了重組質(zhì)粒在上述腫瘤細胞中的表達活性明顯比原質(zhì)粒高，也即以SV40增強子修飾后HPSE啟動子(驅(qū)動熒光蛋白表達)的活性能得到增強。

總之，本研究擴增了完整的SV40增強子序列，并按照實驗要求成功的構(gòu)建了重組質(zhì)粒pEGFP-HPSEp-SV40enh，轉(zhuǎn)染人腫瘤細胞以分析其活性，初步探索了以增強子序列修飾提高HPSE啟動子活性的途徑，為今后更好地利用腫瘤特異性啟動子靶向殺傷腫瘤奠定實驗基礎(chǔ)［5，9］。

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