楊益善，唐 俐，蔡衛(wèi)青，鄧曉湘，盛夏冰

（1.中南大學研究生院雜交水稻國家重點實驗室，湖南長沙410125；2湖南省農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所，湖南長沙410125）

自從1996年轉(zhuǎn)基因作物開始商業(yè)化種植以來，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積快速增長。國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應用服務(wù)組織（International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA）的報告顯示，2010年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積1.48億hm2，占全球總種植面積的10%，其中耐除草劑轉(zhuǎn)基因作物種植面積最大，為8930萬hm2，占轉(zhuǎn)基因作物總面積的61%[1]。耐除草劑轉(zhuǎn)基因作物主要為耐草甘膦和耐草銨膦作物，此外還有耐咪唑啉酮類、磺酰脲類、溴苯腈、烯禾啶、阿特拉津等除草劑的作物（http://www.bioon.com/bioindustry/agriculture/342246.shtml）。中國從20世紀80年代開始轉(zhuǎn)基因水稻研究，經(jīng)過近20a的努力,取得了重大進展,尤其是抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻研究處于世界領(lǐng)先地位,2009年8月華中農(nóng)業(yè)大學選育的抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號和Bt汕優(yōu)63獲得了農(nóng)業(yè)部發(fā)放的生產(chǎn)應用安全證書[2～3]。盡管目前中國的轉(zhuǎn)基因水稻并沒有受到國外基因?qū)＠南拗苹蛲{，不存在知識產(chǎn)權(quán)問題[4]，但由于轉(zhuǎn)基因糧食作物的安全性問題在中國飽受爭議，因此轉(zhuǎn)基因水稻尚未在生產(chǎn)中大面積推廣應用[5]。

將抗除草劑外源基因?qū)胨净謴拖祷虿挥?，并配組選育耐除草劑雜交水稻組合，除可以有效解決稻田草害問題、促進水稻輕簡栽培技術(shù)的推廣之外，還可以實現(xiàn)雜交水稻種子純度的快速鑒定，規(guī)避兩系雜交水稻制種風險，或者實現(xiàn)雜交水稻全程機械化制種，對雜交水稻安全高效生產(chǎn)具有重要現(xiàn)實意義[6]。國內(nèi)相繼開展了耐除草劑轉(zhuǎn)基因水稻的研究[7～8]，通過轉(zhuǎn)基因方法或雜交轉(zhuǎn)育方法，先后培育出一批耐除草劑的水稻恢復系和不育系親本材料[9～14]，以及耐除草劑兼抗蟲、耐除草劑兼耐旱的多抗轉(zhuǎn)基因水稻材料[15～17]。目前，中國耐除草劑轉(zhuǎn)基因水稻研究已進入生產(chǎn)性試驗階段。

湖南雜交水稻研究中心在與中科院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所合作將Bar基因轉(zhuǎn)入早稻品系D 68育成耐除草劑早稻Bar68-1的基礎(chǔ)上，進一步開展了耐除草劑水稻的雜交轉(zhuǎn)育研究，從香125S×Bar68-1的雜交后代中，通過多年系譜選擇，結(jié)合除草劑抗性篩選，選育出新的耐除草劑早稻品系Bar568，并用其與株1S、準S、湘陵628S等光溫敏核不育系配組育成了Bar株兩優(yōu)568、Bar準兩優(yōu)568、Ba r陵兩優(yōu)568等耐除草劑兩系雜交早稻新組合。在耐除草劑兩系雜交水稻的幼苗期噴施除草劑草銨膦，可以殺死雜交水稻中混雜的不育系自交株及其它串粉雜株，從而確保大田生產(chǎn)中雜交水稻的純度。但除草劑用量過大時，在殺死不含Bar基因的雜株的同時，也可能對含Bar基因的耐除草劑雜交水稻秧苗造成傷害。本試驗主要研究草銨膦對不耐除草劑水稻幼苗的致死劑量以及不同草銨膦用量對耐除草劑水稻生長發(fā)育的影響，以確定其適宜用量，為耐除草劑兩系雜交水稻的生產(chǎn)應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2010年在湖南雜交水稻研究中心試驗基地（長沙）進行。供試水稻品種為含Bar基因的耐除草劑兩系雜交早稻新組合Bar準兩優(yōu)568（準S/Ba r568）、Ba r株兩優(yōu)568（株1S/Bar568）及耐除草劑親本Bar568、Bar227A，不含Bar基因的水稻光溫敏核不育系株1S、香125S、陸18S、準S、廣占63S、新安S。供試草銨膦為臺灣巴斯夫股份有限公司出品的13.5%（150g/L）巴斯達除草劑（Basta，又名草銨膦、草丁膦）。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同草銨膦用量對耐除草劑水稻秧苗素質(zhì)的影響 以Bar準兩優(yōu)568、Ba r株兩優(yōu)568、Ba r 568為供試材料，3月26日播種，用353孔軟盤（61cm×33cm）單粒點播發(fā)芽整齊一致的優(yōu)質(zhì)芽谷，薄膜覆蓋濕潤育秧。4月20日（秧苗3.5葉左右）用微型噴霧器均勻噴施草銨膦溶液。草銨膦用量設(shè)3個處理，分別為草銨膦純量 15，45，75mg/m2，均對水 100mL/m2噴施 (相當于每個秧盤噴施20 mL)，以噴施等量清水為對照（CK），每處理3次重復，每重復100苗。

噴施草銨膦后逐日觀察秧苗受害程度，噴施草銨膦3d后秧田灌深水防低溫冷害，噴施草銨膦7d后考查秧苗素質(zhì)：單株分蘗數(shù)、主莖綠葉數(shù)、苗高（秧苗發(fā)根處至最高葉的葉尖的長度）、葉挺長（秧苗發(fā)根處至心葉以下最高葉枕處長度）每品種每重復隨機調(diào)查20株，取平均值；隨機取10株秧苗，平放緊靠在一起，測假莖基部最寬處的寬度，再除以10計算單株莖基寬；隨機取50株秧苗，小心洗凈根系，分離地上部和根系，用吸水紙吸干莖葉和根系表面水分后，分別稱量地上部和根系鮮重，再將地上部和根系分別裝袋，用105℃殺青30min后80℃烘干至恒重，分別稱量地上部和根系干重，最后折算成單株地上部鮮重、單株根系鮮重、單株地上部干重、單株根系干重。

1.2.2 草銨膦對非抗性水稻植株的致死劑量 以Bar568、Bar株兩優(yōu) 568、Bar227A、株 1S、香 125S、陸 18S、準 S、廣占 63S、新安S為供試材料，3月28日播種，用353孔軟盤單粒點播發(fā)芽整齊一致的優(yōu)質(zhì)芽谷，薄膜覆蓋濕潤育秧。設(shè)草銨膦用量 15 mg/m2、45 mg/m2、75mg/m23 個處理，每處理 100 苗，不設(shè)重復。為了觀察軟盤育秧與秧田常規(guī)育秧的區(qū)別，將15mg/m2用量處理的廣占63S、新安S、香125S種子按軟盤育秧相同的密度直接點播在秧廂泥面上。草銨膦噴施時期和方法同試驗“1.2.1”。噴施草銨膦后逐日觀察秧苗受害程度，確定致死劑量。

1.2.3 草銨膦適宜用量的進一步驗證 根據(jù)草銨膦對不含Bar基因不育系的軟盤秧致死劑量試驗結(jié)果，進一步設(shè)置不同草銨膦用量處理，驗證其對秧苗素質(zhì)的影響。以Bar株兩優(yōu) 568、Bar568、株 1S、廣占 63S、新安 S為供試品種，采用軟盤濕潤育秧和秧田常規(guī)濕潤育秧2種育秧方式進行對比處理。草銨膦用量設(shè) 0（CK，噴施清水），15 mg/m2，30 mg/m2，45 mg/m2，75 mg/m25個處理，均兌水100mL/m2，用微型噴霧器均勻噴施，Bar株兩優(yōu)568、Ba r 568每處理3次重復；株1S、廣占63S、新安 S只設(shè) 15 mg/m2，30 mg/m2，45 mg/m23 個用量處理，不設(shè)重復，驗證其致死劑量。軟盤育秧每品種每重復單粒點播芽谷100粒，秧田常規(guī)育秧按播種量30 g/m2均勻撒播。5月2日播種，5月14日噴施草銨膦，此時各處理秧苗為2葉1心至3葉期。噴施草銨膦后逐日觀察秧苗受害程度，5月25日取樣考查秧苗素質(zhì)，考查項目與方法同試驗“1.2.1”。

1.2.4 不同草銨膦用量對產(chǎn)量及群體生長發(fā)育的影響 以Bar株兩優(yōu)568為供試材料，3月26日播種，用353孔軟盤濕潤育秧，每盤播種30g，均勻撒播，薄膜覆蓋。草銨膦用量設(shè)0（CK，噴施清水）、45mg/m2和 75mg/m23個處理，草銨膦噴施時期和方法同試驗“1.2.1”。4月23日移栽，小區(qū)面積13.3m2，隨機區(qū)組排列，3次重復。移栽規(guī)格16.7 cm×20.0cm，每小區(qū)移栽400穴，每穴插2～3本，小區(qū)間空1行，四周留保護行3行以上。常規(guī)肥水管理。秧苗轉(zhuǎn)青后，每小區(qū)調(diào)查2點共50穴的基本苗數(shù)，同時每點定5穴，每4d 1次，調(diào)查分蘗動態(tài)；成熟期每小區(qū)調(diào)查2點共50穴的有效穗數(shù)，同時每點按平均數(shù)法取樣5穴考種；各小區(qū)割除四周3行邊行后，連續(xù)收割100株，脫粒曬干測產(chǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 草銨膦對不含Ba r基因水稻秧苗的致死劑量

噴施草銨膦后2d，各草銨膦用量處理的所有供試品種均開始出現(xiàn)受害癥狀：葉片變黃、出現(xiàn)褐斑。但是含Bar基因的耐除草劑品種Bar568、Bar株兩優(yōu)568、Bar227A受害較輕，葉片顏色與不含Bar基因的品種株1S、陸18S、準S、香125S、廣占63S、新安S有較明顯差異。草銨膦用量越大，各品種的受害程度越嚴重。草銨膦用量15mg/m2的處理中，采用廂面濕潤育秧的廣占63S、新安S、香125S秧苗的受害程度明顯輕于采用軟盤育秧的株1S、陸18S、準S。此后隨著時間的推移，含Bar基因與不含Ba r基因的品種間受害程度差異愈加明顯。Bar568、Bar株兩優(yōu)568、Bar227A在噴施草銨膦后4d，除部分老葉變黃或存在褐斑外，葉片基本保持綠色，此后開始逐漸恢復正常生長；而不含Bar基因的不育系在噴施草銨膦后4d，除用量15mg/m2處理采用廂面濕潤育秧的廣占63S、新安S、香125S秧苗還保留部分綠葉外，其余處理秧苗全部葉片已基本變黃，此后逐漸枯黃，至噴施草銨膦后8d，除用量15mg/m2處理采用廂面濕潤育秧的廣占63S、新安S、香125S有極少數(shù)秧苗存活（恢復綠色）外，各處理秧苗全部枯死。

驗證試驗結(jié)果與此基本一致，據(jù)噴施草銨膦后9d觀察，草銨膦用量15mg/m2的處理，不含Ba r基因的不育系的軟盤育秧秧苗全部枯黃，廂面常規(guī)育秧秧苗絕大部分枯黃；草銨膦用量30mg/m2和45mg/m2的處理，不含Ba r基因的不育系的軟盤育秧秧苗和廂面常規(guī)育秧秧苗均全部枯黃，而含Bar基因的耐除草劑品種秧苗生長正常。

上述結(jié)果表明，不含Bar基因的不育系軟盤濕潤育秧的草銨膦致死劑量≤15mg/m2、廂面常規(guī)濕潤育秧的草銨膦致死劑量≤30mg/m2，不同不育系之間差異不大；噴施草銨膦對耐除草劑親本和雜交稻組合的秧苗生長有一定延緩和傷害作用，噴后2d葉片即出現(xiàn)受害癥狀，但4～6 d后可逐漸恢復正常生長。

2.2 噴施草銨膦對耐除草劑水稻秧苗素質(zhì)的影響

在軟盤濕潤育秧秧苗3.5葉左右噴施草銨膦后，耐除草劑的各品種均先后出現(xiàn)了受害癥狀，草銨膦用量越大的處理受害越重。噴施草銨膦后7d取樣調(diào)查秧苗素質(zhì)，表1結(jié)果表明，不同草銨膦用量處理間秧苗素質(zhì)差異顯著，隨草銨膦用量的增大，秧苗素質(zhì)顯著變差。其中草銨膦用量15mg/m2的處理除單株根系干重顯著低于對照外，其余指標均與對照差異不顯著；草銨膦用量45mg/m2的處理單株綠葉數(shù)、苗高、葉挺長、單株地上部干重和單株根系干重均顯著低于對照，而草銨膦用量75mg/m2的處理全部指標均顯著低于對照。不同品種間各性狀變化趨勢基本一致。說明噴施15mg/m2草銨膦對耐除草劑水稻秧苗素質(zhì)沒有顯著影響，而草銨膦用量大于45mg/m2時，耐除草劑水稻秧苗素質(zhì)顯著變差。

進一步的驗證試驗結(jié)果與第1次試驗結(jié)果基本一致。采用軟盤濕潤育秧方式的各處理，隨草銨膦用量的增大，秧苗素質(zhì)呈現(xiàn)變差的趨勢，噴施草銨膦15 mg/m2～75mg/m2各處理的秧苗素質(zhì)指標均低于對照（表2），說明噴施15mg/m2草銨膦即可對耐除草劑水稻的軟盤濕潤育秧秧苗素質(zhì)產(chǎn)生顯著影響。采用秧廂常規(guī)濕潤育秧方式的各個處理，隨草銨膦用量的增大，秧苗素質(zhì)也整體上呈現(xiàn)變差的趨勢，但是，噴施草銨膦15 mg/m2～30mg/m2的處理秧苗素質(zhì)與對照差異不顯著（表3），說明草銨膦用量不高于30mg/m2時，對采用秧廂常規(guī)濕潤育秧的耐除草劑水稻的秧苗素質(zhì)沒有顯著影響。

表1 不同草銨膦用量對耐除草劑水稻軟盤濕潤育秧秧苗素質(zhì)的影響 （2010）

表2 不同草銨膦用量對耐除草劑水稻軟盤濕潤育秧秧苗素質(zhì)的影響 （驗證試驗，2010）

2.3 噴施草銨膦對耐除草劑水稻產(chǎn)量及群體生長發(fā)育的影響

由表4可見，隨草銨膦用量的增大，Ba r株兩優(yōu)568產(chǎn)量以及株高、有效穗和每穗粒數(shù)均呈現(xiàn)下降趨勢，而生育期有延長的趨勢，但不同草銨膦用量處理間差異均不顯著。從群體發(fā)育動態(tài)（表5）看，噴施草銨膦的處理基本苗相對不足，分蘗期間莖蘗數(shù)均低于對照，分蘗高峰期也均落后于對照，最終有效穗偏少。究其原因，秧田噴施草銨膦的處理，秧苗均受到了一定傷害，噴施草銨膦后的幾天內(nèi)秧苗生長發(fā)育停滯不前，大田移栽時尚未完全恢復正常生長，秧苗素質(zhì)較差，加上移栽后遇上連續(xù)低溫，導致部分弱苗死亡，基本苗偏少，且分蘗延遲，苗峰偏低。

表3 不同草銨膦用量對耐除草劑水稻秧廂常規(guī)濕潤育秧秧苗素質(zhì)的影響 （驗證試驗，2010）

表4 不同草銨膦用量對耐除草劑水稻Bar株兩優(yōu)568產(chǎn)量的影響 （2010）

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，在幼苗期噴施除草劑草銨膦可以殺死不含Bar基因的非抗性水稻不育系植株，草銨膦對采用不同育秧方式的不育系秧苗的致死劑量有所不同，軟盤育秧致死劑量≤15mg/m2，廂面濕潤育秧致死劑量≤30mg/m2。

表5 不同草銨膦用量對耐除草劑水稻Bar株兩優(yōu)568單株分蘗動態(tài)的影響 （2010）

在幼苗期噴施草銨膦對耐除草劑水稻秧苗會產(chǎn)生不同程度的傷害作用，隨草銨膦用量增加，秧苗受害程度加重，秧苗素質(zhì)變差。對軟盤育秧而言，草銨膦用量15 mg/m2～30mg/m2即可顯著降低秧苗素質(zhì)，秧廂常規(guī)濕潤育秧抗逆能力較強，草銨膦用量45 mg/m2～75mg/m2才能顯著降低其秧苗素質(zhì)。噴施草銨膦45 mg/m2～75mg/m2后的受害軟盤秧苗移栽大田后，生長發(fā)育延遲，分蘗高峰和始穗期不同程度推遲，穗粒性狀和產(chǎn)量呈現(xiàn)下降趨勢，但與不噴草銨膦的對照差異并不顯著，說明水稻秧苗移栽大田后具有一定的自我調(diào)節(jié)能力，通過合理的肥水管理，可以減輕甚至消除幼苗期噴施草銨膦產(chǎn)生的不利影響。

3.2 討論

草銨膦是一種廣譜滅生性觸殺除草劑，毒性低，在土壤中易降解，對作物安全，活性高，0.4kg/hm2用量就可很好地防除一年生雜草，1.0kg/hm2～2.0kg/hm2用量可很好地防除多年生雜草，能防除100種以上的禾本科和闊葉雜草，目前是世界上第2大轉(zhuǎn)基因作物耐受除草劑(http://www.bioon.com/bioindustry/agriculture/342246.shtm l)。Bar基因編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT），能使草銨膦失活，是中國耐除草劑轉(zhuǎn)基因水稻研究中利用的主要功能基因之一。

目前中國耐除草劑轉(zhuǎn)基因水稻研究主要集中于基因轉(zhuǎn)化、雜交轉(zhuǎn)育和安全評價等方面，尚處于生產(chǎn)性試驗階段，有關(guān)其應用研究的報道較少。段發(fā)平等[18]研究認為，噴施體積分數(shù)為0.3%及其以上的Liberty除草劑(草銨膦，原液有效成份為170 g/L)水溶液均可殺死非抗性水稻品種幼苗，但未指明具體用量。本試驗發(fā)現(xiàn)，草銨膦對采用軟盤育秧和廂面濕潤育秧的非抗性不育系秧苗的致死劑量不同。這可能是由于軟盤育秧受到盤孔的限制，秧苗生長空間小，秧苗素質(zhì)較差，受草銨膦危害后不利于恢復生長，因而致死劑量較小；而廂面濕潤育秧沒有受到軟盤限制，且播種密度相對較稀，有利于根系擴展和對肥水的吸收，個體生長更充分，對草銨膦的耐性較強，致死劑量較大。

據(jù)有關(guān)報道，耐草銨膦作物對草銨膦的安全劑量高達200mg/m2以上（http://www.bioon.com/bioindustry/agriculture/342246.shtm l）。本試驗中，在幼苗期噴施草銨膦15mg/m2～75mg/m2對耐除草劑水稻秧苗會產(chǎn)生不同程度的傷害作用，對產(chǎn)量的影響雖然不顯著，但也表現(xiàn)出下降趨勢。因此，耐除草劑水稻在生產(chǎn)中應用時，除草劑用量要合理，不宜盲目使用。

綜合本試驗結(jié)果，可以初步認為，當耐除草劑兩系雜交水稻制種中因遇異常低溫或其它原因?qū)е路强剐圆挥惦s株超標時，可以在秧苗期噴施草銨膦除雜而保障大田禾苗純度。為減輕草銨膦對耐除草劑水稻秧苗的不利影響，宜采用秧田濕潤育秧，稀播勻播培育壯秧，草銨膦用量以30mg/m2為宜（對水量100ml/m2），若采用軟盤育秧，草銨膦用量15mg/m2即可；考慮到秧苗的恢復生長期，草銨膦噴施時期以2.5～3.0葉為好；秧苗恢復正常生長后再帶泥移栽，盡量減少植傷，移栽大田后注意加強肥水管理，促進禾苗生長。

[1]James C.Global Status of Commercialized Biotech/GMCrops:2010[EB/OL].http://www.isaaa.org/purchasepublications/itemdescription.asp?ItemType=BRIEFS&Control=IB042-2010.

[2]朱禎.轉(zhuǎn)基因水稻研發(fā)進展[J].中國農(nóng)業(yè)科技導報,2010,12(2):9-16.

[3]唐麗,譚炎寧,韓小霞,等.抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻研究進展及發(fā)展趨勢[J].雜交水稻,2011,26(1):1-6.

[4]陳芬,羅伯祥,肖國櫻.專利分析:誰是中國轉(zhuǎn)基因水稻的真正主人?[J].雜交水稻,2011,26(6):1-5.

[5]肖國櫻,陳芬,孟秋成,等.轉(zhuǎn)基因水稻食用安全性評價內(nèi)容與主要爭論問題分析[J].雜交水稻,2012,27(1):1-6.

[6]肖國櫻.作物對除草劑的抗性及其在雜種優(yōu)勢利用中應用策略的探討[J].雜交水稻,1997,12(5):1-3.

[7]朱冰,黃大年,楊煒,等.利用基因槍法獲得可遺傳的抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻植株[J].中國農(nóng)業(yè)科學,1996,29(6):15-20.

[8]劉自剛,張雁.抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻研究進展[J].中國稻米,2006,(5):4-6.

[9]張祥喜,陳光宇,華志華,等.秈型雜交水稻恢復系“752”抗除草劑轉(zhuǎn)基因研究[J].江西農(nóng)業(yè)學報,2000,12(4):1-7.

[10]黎垣慶,許秋生,段發(fā)平,等.抗除草劑雜交稻的選育[J].雜交水稻,2000,15(6):9-11.

[11]薛石玉,劉建慧,吳 躍.水稻轉(zhuǎn)bar基因恢復系選育初報[J].雜交水稻,1999,14(3):11-12.

[12]王才林,趙凌,宗壽余,等.水稻抗除草劑基因bar的轉(zhuǎn)育研究[J].作物學報,2002,28(3):305-309.

[13]肖國櫻,唐俐,袁定陽,等.轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑兩系雜交早稻恢復系Bar 68-1的培育研究[J].雜交水稻，2007,22(6):57-61.

[14]傅亞萍,朱正歌,肖晗,等.抗除草劑基因?qū)肱喟?4S實現(xiàn)雜交水稻制種機械化的初步研究[J].中國水稻科學,2001,15(2):97-100.

[15]鄧力華.抗除草劑和多價抗蟲基因?qū)胨竟鉁孛艉瞬挥档难芯縖D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文,2008.

[16]陳 麗,鄧力華,陳 芬,等.轉(zhuǎn)Cry1Ca和Bar基因水稻的獲得與性狀鑒定[J].農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究,2012,33(1):104-107.

[17]陳芬,杜洪偉,陳浩東,等.干旱響應轉(zhuǎn)錄因子DREB1A基因?qū)胨竟鉁孛艉瞬挥档难芯縖J].生命科學研究,2008,12(1):24-28.

[18]段發(fā)平,黎垣慶,梁承鄴.不同濃度除草劑和處理時期對轉(zhuǎn)Bar基因水稻農(nóng)藝性狀的影響[J].雜交水稻,2001,16(6):44-46.