呂海鴻

河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南鄭州 450003

復(fù)方益母口服液中水溶性生物堿-鹽酸水蘇堿的HPLC法測(cè)定研究

呂海鴻

河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南鄭州 450003

目的 建立復(fù)方益母口服液中水溶性生物堿-鹽酸水蘇堿的含量測(cè)定方法。 方法 用雷氏鹽沉淀法處理樣品，對(duì)提純出的鹽酸水蘇堿采用HPLC法測(cè)定含量。色譜柱為Agela Venusil XBP NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-醋酸溶液（用少量醋酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至3.00±0.15）（77∶23）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，柱溫為35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm。 結(jié)果復(fù)方益母口服液中鹽酸水蘇堿的進(jìn)樣量在1.083 1～32.491 8 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 9），平均回收率為91.1%，RSD=3.7%（n=6）。 結(jié)論 該方法精確可靠，專屬性強(qiáng)，可作為復(fù)方益母口服液中鹽酸水蘇堿的質(zhì)量控制方法。

復(fù)方益母口服液；HPLC法；鹽酸水蘇堿；雷氏鹽沉淀法

復(fù)方益母口服液是由益母草、當(dāng)歸、川芎等藥經(jīng)加工制成的口服液，具有活血行氣，化瘀止痛的功能，用于氣滯血瘀所致的痛經(jīng)，原為國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第19冊(cè)收載品種[1]。益母草是君藥，其指標(biāo)性成分是鹽酸水蘇堿，原標(biāo)準(zhǔn)采用薄層掃描法（TLCS）測(cè)定水蘇堿含量，由于方劑中并存其他的生物堿，TLCS法對(duì)水蘇堿的選擇性和專屬性均差，含量不準(zhǔn)確。為此，特研究起草了HPLC法測(cè)定復(fù)方益母口服液中鹽酸水蘇堿的含量，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確性好，可為標(biāo)準(zhǔn)提高提供修訂依據(jù)。

1 儀器與試藥

戴安高效液相色譜儀UltiMate3000系列。鹽酸水蘇堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110712-200709，供含量測(cè)定用）；復(fù)方益母口服液由河南太龍藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為 10121512、10072011、10031315，水為純化水，甲醇為色譜純，醋酸等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱：AgelaVenusilXBPNH2柱（4.6mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A∶B=乙腈-醋酸溶液（用少量醋酸調(diào)接溶液的pH值至 3.00±0.15）（77∶23），柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：200 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。理論板數(shù)按鹽酸水蘇堿峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取鹽酸水蘇堿對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相B制成每1毫升含0.5 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取本品10 mL，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2.0，加入新制的2%雷氏鹽溶液10 mL，冰浴中放置1 h，用G4垂熔玻璃漏斗濾過(guò)，沉淀用冰水30 mL洗滌后，用丙酮溶解。向丙酮液中加等體積的水，搖勻，滴加1%硫酸銀溶液至不再有沉淀生成，離心（每分鐘 2 000 r以上，1～2 min，下同），傾出上清液，沉淀用丙酮1～2 mL洗滌，離心，合并兩次上清液并適當(dāng)濃縮至5 mL。再向濃縮液中滴加2%氯化鋇溶液至不再有沉淀生成，離心，傾出上清液，沉淀用水1～2 mL洗滌，離心，合并兩次上清液并蒸至近干，用水全部轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

依據(jù)處方中的比例，按制法制備缺益母草藥材的陰性對(duì)照樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖（圖1）。結(jié)果陰性對(duì)照溶液在鹽酸水蘇堿色譜峰相應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，供試品溶液在相應(yīng)的保留時(shí)間處有色譜峰出現(xiàn)，并且與相鄰峰的分離度大于1.5，表明所建立方法的專屬性高，雜質(zhì)對(duì)主成分的測(cè)定無(wú)干擾。

?

2.5.1 線性關(guān)系考察。配制濃度為0.541 53 mg/mL的對(duì)照品溶液，分別精密吸取 2、4、7、10、20、30、40、50、60 μL 注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以峰面積積分值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品量X（μg）為橫坐標(biāo)，作線性回歸，得回歸方程A=1.762 8X+0.405 8，r＝0.999 9。結(jié)果表明，鹽酸水蘇堿在 1.083 1～32.491 8 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2 精密度試驗(yàn)。取同一份對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量20 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.1%。表明精密度良好。

2.5.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)。取同一批號(hào)（批號(hào)：10031315）供試品，按供試品溶液制備方法制備6份供試液，分別測(cè)定鹽酸水蘇堿含量，結(jié)果平均含量為0.873 mg/mL，RSD=3.1%。表明重復(fù)性較好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。 取同一份對(duì)照品溶液，于 0、2、5、8、11、15 h分別進(jìn)樣，測(cè)定鹽酸水蘇堿峰面積，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果峰面積RSD=1.8%。表明供試品溶液在15 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn)。精密稱取鹽酸水蘇堿對(duì)照品適量，加流動(dòng)相B制成2.036 43 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密量取已知含量的供試品（批號(hào)10031315，含量0.848 mg/mL）5 mL共6份，分別精密加入上述鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液1 mL，按供試品溶液的制備方法制備供試液，分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

由于供試品溶液的制備過(guò)程反應(yīng)多，步驟較繁瑣，前處理中的一些損失會(huì)對(duì)回收率高低有一定影響，考慮到方法重現(xiàn)性較好，回收率結(jié)果較穩(wěn)定，所建立方法是可行的。

2.5.6 耐用性試驗(yàn)。換用不同廠家的色譜柱，通過(guò)微調(diào)流動(dòng)相比例和pH值，每根柱子的系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)均可達(dá)到滿意的結(jié)果。所用的色譜柱a：Lanbo的 Kromasil NH2柱，4.6 mm×250 mm×5 μm；柱 b：依利特的 Hypersil NH2柱，4.6 mm×250 mm×5 μm；柱 c：Agilent的 ZORBAX NH2柱，4.6 mm×250 mm×5 μm。

2.6 樣品含量測(cè)定

取復(fù)方益母口服液 3批 （批號(hào)：10121512、10072011、10031315），按“2.2”、“2.3”項(xiàng)下方法分別制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果3批鹽酸水蘇堿的含量分別為0.892、0.958、0.848 mg/mL。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 本文色譜條件篩選時(shí)曾采用C18柱分離，因鹽酸水蘇堿極性較大，結(jié)果在C18柱上保留很??；后采用氨基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱則保留時(shí)間適宜，色譜峰分離較好。

3.1.2 從鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液紫外光譜圖知鹽酸水蘇堿最大吸收為192 nm，屬于末端吸收，為提高檢測(cè)靈敏度，故采用截止波長(zhǎng)較低的乙腈（190 nm）為有機(jī)相，測(cè)定波長(zhǎng)定為200 nm。

3.1.3 流動(dòng)相B采用醋酸溶液，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)pH值對(duì)鹽酸水蘇堿峰形影響較大，當(dāng)從pH 6到pH 2.5范圍變化時(shí)，色譜峰形從拖尾變化為前延，其中在pH 3.00±0.15處可獲得對(duì)稱峰，可用少量醋酸來(lái)調(diào)接溶液的pH值。改變A∶B為60∶40、75∶25、77∶23、80∶23，試驗(yàn)不同的流動(dòng)相比例，以 77∶23 時(shí)鹽酸水蘇堿峰與鄰近峰分離度好，保留時(shí)間適宜，為最佳。

3.2 供試品溶液制備方法的選擇

3.2.1 益母草藥材及含益母草制劑大多以鹽酸水蘇堿作為定量指標(biāo)，而鹽酸水蘇堿是水溶性生物堿，易溶于水，從供試品前處理的操作上看，對(duì)于藥材及固體制劑如片劑、膠囊、顆粒劑、膏劑等，大多利用鹽酸水蘇堿的水溶性，只需簡(jiǎn)單的醇提水沉或活性炭除雜、固相萃取小柱等除雜，即可除掉大部分雜質(zhì)，進(jìn)而進(jìn)行后續(xù)的分析測(cè)定[2-4]。但對(duì)于溶液狀制劑如口服液、合劑等，鹽酸水蘇堿已存在于水相中，無(wú)法利用其水溶性特點(diǎn)直接提取測(cè)定，文獻(xiàn)[5-8]多采用雷氏鹽沉淀法除雜提純。在供試液配制方法篩選之初，嘗試采用口服液樣品稀釋后直接進(jìn)樣，但出峰雜亂，共存成分對(duì)主峰干擾太大；采用口服液樣品用乙酸乙酯或氯仿或正丁醇提取除雜后進(jìn)樣，結(jié)果未有改善；最后仍采用此類水溶性生物堿的經(jīng)典測(cè)定方法，通過(guò)雷氏鹽-硫酸銀-氯化鋇法除雜并制得主要成分為鹽酸水蘇堿的進(jìn)樣溶液，注入HPLC儀分析，得到的HPLC色譜圖雜質(zhì)峰少，專屬性強(qiáng)，也有較好的重現(xiàn)性和回收率。

3.2.2 雷氏鹽沉淀法操作步驟較多，每步都需謹(jǐn)慎操作，才能得到較好的重現(xiàn)性。本法經(jīng)多次試驗(yàn)，細(xì)化并改進(jìn)了操作步驟，使方法更具操作性、可控性和重現(xiàn)性。與原法[1]比較，有以下改進(jìn)：（1）用少量稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值即可，可減少濃鹽酸的揮發(fā)及利于調(diào)節(jié)pH值。（2）明確了垂熔玻璃漏斗為G4，保證重現(xiàn)性。（3）冰水洗滌由10 mL改為30 mL，較充分洗去雜質(zhì)。（4）滴加硫酸銀溶液前丙酮提取液先加等體積水改變?nèi)軇┬再|(zhì)，有效改變了原方法滴加硫酸銀水溶液到有機(jī)溶劑中初期因溶解度改變而有沉淀析出的干擾。（5）滴加硫酸銀溶液濃度由0.5%改為1%，使滴加溶液盡量減少，利于后面濃縮操作。（6）邊滴加反應(yīng)液，邊沉淀，邊離心的操作，可清楚觀察到反應(yīng)結(jié)束，即不再有沉淀生成。（7）滴加氯化鋇的操作改進(jìn)和思路同上述（5）和（6）。

將含量測(cè)定方法由TLCS法改為HPLC法，具有操作簡(jiǎn)便、選擇性和專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確性好的特點(diǎn)，可用于復(fù)方益母口服液的質(zhì)量控制；而在以后的研究中，將對(duì)復(fù)方益母口服液中水溶性生物堿的簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的前處理方法做進(jìn)一步的探索。

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Determination of water soluble alkaloids-stachydrine hydrochloride in Complex Yimu Oral Liquid by HPLC

LV Haihong
Institute for Food and Drug Control of Henan Province,Zhengzhou 450003,China

ObjectiveTo establish a method for the content determination of water soluble alkaloids-stachydrine hydrochloride in Complex Yimu Oral Liquid.Methods The sample solution was prepared with the method of Reinecke salt precipitation and was determined the content by HPLC.The column was Agela Venusil XBP NH2column(4.6 mm×250 mm，5 μm)and CH3CN-H2O(pH was adjusted to 3.00±0.15 by acetic acid)(77∶23)was used as the mobile phase,with the flow rate of 1.0 mL/min.The column temperature was at 35℃and the detection wavelength was 200 nm.Results The good linear ranges were between 1.083 1-32.491 8 μg for stachydrine hydrochloride(r=0.999 9,n=6)and the average rate of recovery was 91.1%with RSD=3.7%(n=6).Conclusion The method is accurate,reliable,specific and with good reproducibility.It can be used for the quality control of stachydrine hydrochloride in Complex Yimu Oral Liquid.

Complex Yimu Oral Liquid;Stachydrine hydrochloride;HPLC;Reinecke salt precipitation

R927.2

A

1674-4721（2012）06（a）-0063-03

呂海鴻（1966-），女，碩士，副主任藥師，主要從事藥品檢驗(yàn)和藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

2012-03-27 本文編輯：趙麗萍）