顏梅新，黃偉華，鄧展云，黃誠(chéng)華，韋金菊

（廣西壯族自治區(qū)甘蔗研究所/廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530007）

甘蔗花葉病毒（Sugarcane mosaic virus，SCMV）引起的甘蔗花葉病是重要的甘蔗病害之一，在我國(guó)浙江[1]、福建[2]、廣東[3]、廣西[4]、云南[5]等地甘蔗產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，為害嚴(yán)重。國(guó)內(nèi)外對(duì)SCMV特性、分類(lèi)地位、多樣性等方面進(jìn)行了研究，迄今，報(bào)道了200多個(gè)SCMV分離物CP基因序列，有的還進(jìn)行全基因組序列測(cè)定[6-8]，許東林等2005年對(duì)華南地區(qū)引種基地侵染甘蔗的SCMV遺傳多樣性進(jìn)行報(bào)道[3]。廣西是SCMV的主要發(fā)生地區(qū)之一，但至今尚未對(duì)全區(qū)甘蔗品種品系間感SCMV進(jìn)行調(diào)查，為此我們進(jìn)行了相關(guān)研究。本文簡(jiǎn)要報(bào)道廣西蔗區(qū)侵染甘蔗SCMV的初步調(diào)查結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與總RNA提取

從廣西各主要蔗區(qū)采集不同品種（品系）顯癥的甘蔗樣品，以莖尖組培脫毒的健康植株葉片作為陰性對(duì)照。采用天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒抽提葉組織總RNA，具體步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2 RT-PCR擴(kuò)增

RT-PCR 擴(kuò)增引物根據(jù)文獻(xiàn)[9]合成，上游引物 SCMVF4 （5′-GTTTTYCACCAAGCTGGAACAGTC-3′；Y=C or T），下游引物 SCMVR3 （5′-AGCTGTGTGTCTCTCTGTATTCTC-3′），預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物約 700 bp。RT-PCR 用購(gòu)自寶（大連）生物工程有限公司的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒進(jìn)行，反應(yīng)體系參照試劑盒說(shuō)明，RT 體系：50μL 反應(yīng)體系中總 RNA 約 0.08μg/μL、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL、2×1 Step Buffer 25 μL、引物 SCMVF4 和 SCMVR3（20 μM）各 1 μL ，用 DEPC ddH2O 補(bǔ)足 50 μL。 反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃30min；95℃ 2 min；94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 1min，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 5min。 PCR 反應(yīng)結(jié)束后， 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在UVP凝膠成像系統(tǒng)中觀察檢測(cè)結(jié)果。對(duì)部分RT-PCR產(chǎn)物直接送測(cè)序和BLAST比對(duì)，驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的正確性。

1.3 感病品種（品系）調(diào)查

2010年5—10月間先后從廣西甘蔗研究所、馱盧、憑祥、柳州、柳城、鹿寨、百色、貴港等甘蔗主產(chǎn)區(qū)采集不同品種（品系）顯癥甘蔗樣品進(jìn)行SCMV RT-PCR分子檢測(cè)。

2 結(jié)果

以各地顯癥病葉組織總RNA抽提液為模板，經(jīng)引物對(duì)SCMVF4/SCMVR3進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果所檢測(cè)36份樣品中，其中25份顯陽(yáng)性（占69.4%），獲得預(yù)期大小（約700 bp）的DNA電泳條帶，健康和陰性對(duì)照樣品均無(wú)任何擴(kuò)增電泳（圖1），另外11份未檢出SCMV的顯癥樣品均可檢出SrMV（另文報(bào)道）。其中對(duì)8份擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，結(jié)果有4份樣品獲得核苷酸數(shù)據(jù)，另外有4份測(cè)序不成功（產(chǎn)物濃度低，測(cè)序信號(hào)出現(xiàn)雙峰或多峰）。所得序列在GenBank中比對(duì)，結(jié)果與巴西和中國(guó)云南等地的多個(gè)SCMV分離物有96%～100%同源性，確認(rèn)它們均屬SCMV基因片斷序列。

圖1 一步法RT-PCR檢測(cè)甘蔗植株葉片樣品中的SCMV

在所調(diào)查的品種（品系）中，目前廣西主栽品種ROC22除在柳城蔗區(qū)未檢測(cè)到SCMV（檢測(cè)到SrMV，另文發(fā)表）外，其它蔗區(qū)均檢測(cè)到，ROC22最易受SCMV侵染；其它臺(tái)糖系列如臺(tái)糖16、臺(tái)糖28、臺(tái)糖95-889、臺(tái)優(yōu)均檢測(cè)到SCMV；柳城系列品種柳城03-182，柳城03-1137檢測(cè)結(jié)果也呈陽(yáng)性；廣西甘蔗研究所許多品系也都受到SCMV的感染（見(jiàn)表1）。

表1 廣西蔗區(qū)SCMV調(diào)查結(jié)果

3 討論

本研究所調(diào)查的品種 （品系）中，目前主栽品種ROC22除在柳城蔗區(qū)未檢測(cè)到SCMV（檢測(cè)到SrMV，另文發(fā)表）外，在其他蔗區(qū)均檢測(cè)到SCMV，說(shuō)明ROC22最易受SCMV侵染。廣西蔗區(qū)比較嚴(yán)重的問(wèn)題是品種單一化，連年種植。據(jù)我們2010年調(diào)查，柳州地區(qū)甘蔗品種ROC22感花葉病比較嚴(yán)重，每一塊蔗田平均30%顯花葉癥，有的甚至達(dá)100%。應(yīng)該引起有關(guān)部門(mén)的重視，有效的防治方法是使用健康種苗或者替換品種，更換其它抗病品種。其它臺(tái)糖系列如臺(tái)糖16、臺(tái)糖28、臺(tái)糖95-889、臺(tái)優(yōu)均檢測(cè)到SCMV；柳城系列品種柳城03-182、柳城03-1137也易感染SCMV；廣西甘蔗研究所許多品系也檢測(cè)到SCMV。了解這些情況，對(duì)于育種工作者來(lái)說(shuō)尤為重要，為篩選親本培育抗病品種提供參考。

許東林等對(duì)華南地區(qū)引種基地侵染甘蔗的SCMV遺傳多樣性進(jìn)行研究，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，除廣東分離物SCMV-W31和海南分離物SCMV-N8外，其它分離物高度相近，聚集成一個(gè)獨(dú)立的簇[3]。我們廣西的SCMV遺傳多樣性如何，是否與上述結(jié)果相類(lèi)似，需要做進(jìn)一步研究分析。

[1]蔣軍喜，周雪平，洪健.杭州地區(qū)甘蔗花葉病病原鑒定[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2002，10（4）：377-380.

[2]姚偉，段真珍，周會(huì)，等.甘蔗花葉病毒福建分離物外殼蛋白基因的克隆及序列分析[J].植物病理學(xué)報(bào)，2006，36（4）：378-381.

[3]許東林，周?chē)?guó)輝.侵染華南地區(qū)甘蔗的SCMV遺傳多樣性初探[J].植物病理學(xué)報(bào)，2005，35（6）：143-l44.

[4]秦碧霞，蔡健和，劉志明，等.侵染廣西甘蔗的高粱花葉病毒分子鑒定初報(bào)[J].中國(guó)糖料，2007（4）：29-31.

[5]李文鳳，董家紅，丁銘，等.云南甘蔗花葉病病原檢測(cè)及一個(gè)分離物的分子鑒定[J].植物病理學(xué)報(bào)，2007，37（3）：242-247.

[6]蔣軍喜，謝艷，闕海勇.江西甘蔗花葉病病原的分子鑒定[J].植物病理學(xué)報(bào)，2009，39（2）：203-206.

[7]Grisham，M.P.，andPan，Y.-B.AgeneticshiftinthevirusstrainsthatcausemosaicinLouisianasugarcane[J].PlantDis，2007，91：453-458.

[8]Perera，M.F.，F(xiàn)ilippone，M.P.，Ramallo，C.J.，Cuenya，M.I.，García，M.L.，Ploper，L.D.，and Castagnaro，A.P.Genetic diversity among viruses associated with sugarcane mosaic disease in Tucumán，Argentina[J].Phytopathology，2009，99：38-49.

[9]O.M.Alegria，M.Royer，M.Bousalem，M.Chatenet，M.Peterschmitt，J-C.Girard，and P.Rott.Genetic diversity in the coat protein coding region of eighty-six sugarcane mosaic virus isolates from eight countries，particularly from Cameroon andCongo[J].Arch Virol，2003，148：357-372.