炳嶺，李德龍，胡曉亮，劉在斯，秦立廷，吳 關，劉 文，祁小樂，王永強，高宏雷，高玉龍*，王笑梅*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室/禽傳染病研究室，黑龍江哈爾濱150001；2.黑龍江出入境檢驗檢疫局，黑龍江哈爾濱150090)

禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)屬反轉錄病毒科，禽C性反轉錄病毒屬，可以引起禽類多種腫瘤性疾病。該病在世界各地均有發(fā)生，感染率高，發(fā)病率低，是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一[1]。目前，該病尚無徹底可行的防制措施，迄今為止尚無有效地疫苗，而預防該病的主要方法是培育具有遺傳性抵抗力的新品種，淘汰陽性雞，凈化種群，經(jīng)過幾代選育出無白血病的雞群[2]。自2008年以來，蛋雞感染J亞群白血病病毒在國內(nèi)廣泛流行，并引起產(chǎn)蛋量下降[3-6]。自1868年，Roloff報道禽白血病以來，研究人員在病毒的分離、鑒定、檢測和診斷方面取得了一定的成就，建立了大量的檢測方法，如病毒中和試驗、瓊脂擴散實驗、補體結合試驗、ELISA、放射免疫、免疫熒光技術等[7-8]。ALV的主要蛋白質(zhì)組分為gag基因編碼的核心蛋白、pol基因編碼的3種酶、env基因編碼的2種糖蛋白。在gag編碼的非糖基化蛋白中，p27是主要的群特異性抗原，是一種高度保守的非糖基化蛋白，有許多病毒抗原位點，是制備檢測抗體的首選抗原。本實驗制備針對p27的單克隆抗體(MAb)，有助于ALV感染的檢測和病情監(jiān)測。

1 材料和方法

1.1 病毒株、細胞和血清 ALV-J(HB09JY03)、ALV-A和ALV-B由哈爾濱獸醫(yī)研究所分離鑒定；DF-1、S/P20細胞由本實驗室保存；兔抗天然p27蛋白陽性血清由本實驗室制備。

1.2 菌株及主要試劑 克隆載體pMD18-T、原核表達載體pET-30a、大腸桿菌DH5α和BL21由本實驗室保存；DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收提取試劑盒購自AXYGEN公司；T4DNA連接酶、IPTG、pMD18-T載體等購自寶生物工程(大連)有限公司；HPR標記的羊抗鼠IgG、抗鼠熒光二抗、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；免疫球蛋白亞類鑒定試劑盒購自Southern Biotech公司；1640培養(yǎng)基、HAT、HT購自GibcoBRL；蛋白純化用填充材料購自GE healthcare。

1.3 引物的設計與合成 根據(jù)ALV-J株的序列[9]，采用軟件Primer prem ier 5.0設計一對引物p1、p2用于擴增p27基因，上游引物P1：5'-CGGGATCCATG CCTGTAGTGATTAAGAC-3'，含有 Bam HⅠ酶切位點。下游引物P2：5'-ACGTCGACCTAGGGCTGGAT AGCAGACG-3'，含有SalⅠ酶切位點。

1.4 DNA提取和p27基因的擴增 將ALV-J接種于對數(shù)生長期的DF-1細胞，7d后收集并凍融3次。采用DNA提取試劑盒從DF-1細胞凍融液中提取DNA。并以其為模板進行PCR擴增，反應條件為：94℃ 5m in；94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 1min，35個循環(huán)，72℃10m in。擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 重組表達載體的構建及鑒定 利用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，連接于pMD-18T載體后轉化，提取重組質(zhì)粒，Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定，陽性重組質(zhì)粒命名為pMD-p27并測序。利用Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切質(zhì)粒 pMD-p27和 pET-30a，分別回收720bp和4900bp片段，T4DNA連接酶連接，產(chǎn)物轉化BL21感受態(tài)細菌，小量提取質(zhì)粒，Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定出陽性重組質(zhì)粒，命名為pET-p27。

1.6 p27蛋白的表達、純化及活性檢測 挑取單個含有pET-p27的BL-21細菌菌落加入含Kna(100μg/m L)的LB中，37℃過夜振搖培養(yǎng)，次日擴大培養(yǎng)至OD600nm值約為0.8，加入IPTG至終濃度0.1mM，于37℃誘導6h，收獲細菌。離心后，將菌體用PBS重懸(50μL PBS/m L LB)，于4℃過夜后，超聲波裂解菌體，離心取上清，SDS-PAGE電泳分析。按照文獻[10]方法進行純化，將純化的p27蛋白用兔抗天然p27蛋白陽性血清進行western blot分析。

1.7 動物免疫 向純化的p27蛋白(2mg/m L)中加入等量的弗氏完全佐劑，乳化后皮下注射7周齡BLAB/c小鼠，每只0.05m L；21d后用含等量弗氏不完全佐劑的p27蛋白腹腔注射二次免疫，0.1m L/只，21d后僅用p27蛋白腹腔兼尾靜脈注射(0.05m L/只)加強免疫，3d后取脾臟用于融合。

1.8 陽性雜交瘤細胞株的建立 取免疫鼠脾臟制成細胞懸液與處于對數(shù)生長期的S/P20細胞以8∶1的比例融合。待融合細胞長至孔底1/2或1/3時，通過間接ELISA方法篩選出陽性雜交瘤細胞株，再利用有限稀釋法連續(xù)克隆2次～3次。至陽性率為100%后進行擴大培養(yǎng)，凍存于液氮中。

1.9 p27MAb的制備 將篩選得到的雜交瘤細胞進行擴大培養(yǎng)后，以5×106/0.5m L雜交瘤細胞腹腔注射BLAB/C小鼠1m L，14d后待小鼠腹圍增大后收集腹水，1000r/min離心10min，上清以0.45μm濾器過濾后即為腹水MAb粗制品。

1.10 MAb的效價測定及亞類的測定 將純化的p27蛋白作1∶1000稀釋包被酶聯(lián)反應板，采用間接ELISA方法測定腹水中MAb效價，以P/N>2.5的最大稀釋度作為抗體的效價。采用免疫球蛋白亞類鑒定試劑盒檢測5株p27MAb的亞類。操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.11 特異性鑒定

1.11.1交叉反應鑒定將ALV-J、ALV-A、ALV-B、IBV、MDV、AIV H5、AIV H7、AIV H9、ILTV、FPV、IBDV、NDV、ARV和REV 14種病毒根據(jù)蛋白含量的不同，稀釋至約15μg/m L，包被酶聯(lián)反應板，間接ELISA檢測其與MAb的反應，以DF-1細胞凍融離心后上清液作為陰性對照，PBS作為空白對照。OD450nm>0.2判定為陽性。

1.11.2間接熒光免疫反應鑒定將ALV-J(HB09JY03)、ALV-A和ALV-B接種于含DF-1細胞的24孔細胞板，將未接種病毒的DF-1作為陰性對照。5d后無水乙醇固定 15m in，并將 MAb 2E5、3H8、4B7、6D9和10G2做1∶200稀釋，加入細胞板孔內(nèi)，室溫孵育1h。PBST洗4次，抗鼠熒光二抗做1∶200稀釋避光室溫孵育1h，洗板后加入PBS，熒光顯微鏡觀察結果。

2 結果

2.1 重組質(zhì)粒pET-p27的鑒定 將pET-p27以Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切，所得片段與預期相符，p27基因全長720bp，編碼239個氨基酸殘基。

2.2 p27蛋白的表達、純化及活性檢測 將表達蛋白在非變性條件下純化獲得His-p27融合蛋白，分子量約為34ku(圖1A)，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉移至硝酸纖維素膜上，用兔抗天然p27蛋白陽性血清進行western blot分析，結果所表達的蛋白具有生物反應活性(圖1B)。

2.3 陽性雜交瘤株的建立 細胞融合率為89.4%，最終篩選出5株持續(xù)分泌抗ALV p27蛋白的MAb雜交瘤細胞株，編號分別是2E5、3H8、4B7、6D9和10G2。

2.4 MAb效價及亞類的測定 采用已建立的ELISA方法對 2E5、3H8、4B7、6D9和10G2進行效價測定，結果分別為：27、210、29、27和28。免疫球蛋白亞類鑒定試劑盒測定5株MAb的結果顯示：2E5為IgG2b；3H8、4B7、6D9和10G2均為IgG1。

圖1 誘導表達p27蛋白的SDS-PAGE和western blot分析Fig.1SDS-PAGE(A)and western blot(B)analyse of p27protein

2.5 特異性鑒定 采用不同病毒對MAb進行ELISA檢測，結果顯示IBV、MDV、AIV H5、AIV H7、AIV H9、ILTV、FPV、IBDV、NDV、ARV和REV與5株MAb反應的OD450nm值均小于0.15，并且 ALV-J、ALV-A、ALV-B與 5株 MAb反應的OD450nm值均大于1.2。表明5株MAb有良好的特異性(圖 2)。分析熒光顯微鏡觀察 MAb 2E5、3H8、4B7、6D9和 10G2分 別 與 ALV-J(HB09JY03)、ALV-A和ALV-B呈陽性反應，呈現(xiàn)明顯的綠色熒光，而陰性對照無綠色熒光(圖3)。

圖2 特異性鑒定Fig.2Identification of the specificity of p27MAb

3 討論

圖3 MAb間接熒光免疫反應分析結果Fig.3IFA analysis for p27monoclonal antibody

禽白血病主要危害有兩個方面，一是產(chǎn)生腫瘤，導致雞死亡；二是引起母雞產(chǎn)蛋率下降、蛋重減輕等生產(chǎn)指標的改變；另外還能夠引起雞的免疫抑制，繼發(fā)其他細菌和病毒的感染，造成嚴重的經(jīng)濟損失。1997年和1998年，J亞群禽白血病在世界范圍內(nèi)爆發(fā)，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[11]。近些年來，在國內(nèi)許多省份，ALV-J主要感染15周～29周齡蛋雞，引起產(chǎn)蛋量顯著下降，趾骨周圍皮膚和羽毛處淋巴結出血[6]。

本實驗將ALV p27在BL21E.coli中表達，原核表達系統(tǒng)相對于真核表達系統(tǒng)具有成本低、操作簡便、表達量高等優(yōu)點，并且省去了傳統(tǒng)方法通過提純病毒、去污劑裂解、電泳提純目的蛋白的繁瑣步驟[12-13]。其表達載體pET-30a是一種高效的融合HIS標簽的原核表達系統(tǒng)，經(jīng)過誘導表達的融合蛋白，采用親和層析法純化，從而獲得高純度的目的蛋白，為下一步特異性MAb的獲得奠定了基礎。

在p27MAb制備過程中，本研究采用原核表達的p27蛋白作為免疫原，經(jīng)過細胞融合、篩選及克隆化，最終制備了5株針對p27的MAb。其效價高達107以上，并且分泌抗體穩(wěn)定、特異性高。5株MAb與常見的外源性ALV-J、ALV-A、ALV-B[14]反應特異，能夠觀察到明顯的熒光，而與DF-1不反應，為禽白血病的診斷、防控和凈化奠定了基礎。

本研究為p27蛋白抗原決定簇的研究和ALV在病原學、血清學、組織化學和基因表達等方面的研究提供了有力工具；為禽白血病ELISA抗原診斷試劑盒研制奠定了基礎。

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