王力玄 周佳瑩 馬忠森 (吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院2009級(jí)，吉林 長(zhǎng)春 3002)張 俠 (南航吉林分公司航衛(wèi)室)

肺癌近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)〔1〕，由于各種因素的影響，患者明確診斷時(shí)往往已達(dá)晚期，失去手術(shù)根治的機(jī)會(huì)，故化療成為這類(lèi)患者治療的主要手段。但由于多藥耐藥(MDR)的存在常致使藥物對(duì)肺癌的治療失敗，嚴(yán)重影響化療的效果和預(yù)后。因此，本文應(yīng)用鹽酸氯丙嗪作為化療藥物欖香烯的增敏劑，觀察其對(duì)PLA801D細(xì)胞的增殖抑制作用及細(xì)胞周期進(jìn)程的變化，旨在為肺癌化療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 PLA801D細(xì)胞株購(gòu)于北京解放軍總醫(yī)院;欖香烯乳注射液為大連金港制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)家二類(lèi)抗腫瘤藥，RPMI1640培養(yǎng)基;MTT試劑購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，胎牛血清購(gòu)自長(zhǎng)春生物制品研究所。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PLA801D細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞數(shù)為2×105/ml接種96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 ml，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%匯合時(shí)分為單純欖香烯組20、40、80 μg/ml及空白對(duì)照組，每個(gè)濃度10復(fù)孔 靜止培養(yǎng)24 h后，于培養(yǎng)結(jié)束前6 h加入MTT試劑，每孔內(nèi)20 μl，MTT終濃度為500 mg/L。繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，每孔內(nèi)分別加入二甲基亞砜溶液150 μl/孔。10 min后于酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)試各孔吸光度A值，根據(jù)下列公式計(jì)算PLA801D細(xì)胞增殖抑制率:PLA801D細(xì)胞抑制率=(1－加藥孔細(xì)胞A值÷對(duì)照孔細(xì)胞A值)×100%

1.2.2 聯(lián)合組用藥方法 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取40 μg/ml欖香烯組再加入4 mg/ml氯丙嗪為聯(lián)合組。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù) 細(xì)胞分組同1.2.2，不同之處是將96孔塑料培養(yǎng)板改為25 μl培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后收集不同濃度欖香烯作用的PLA801D細(xì)胞，離心棄上清，加入70%冷乙醇固定4℃內(nèi)保存，上機(jī)前過(guò)40目尼龍網(wǎng)，調(diào)細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，PI染色流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果以Modifi 2.0軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.0軟件，細(xì)胞周期分析采用F檢驗(yàn)，細(xì)胞增殖抑制率分析采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PLA801D細(xì)胞增殖抑制率 MTT結(jié)果顯示單純欖香烯組20、40、80 μg/ml組隨著欖香烯濃度的增加細(xì)胞抑制率增高。三組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;但是聯(lián)合組(40 μg/ml欖香烯聯(lián)合4 mg/ml氯丙嗪)效果最佳，細(xì)胞抑制率超過(guò)單純80 μg/ml欖香烯組。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度欖香烯對(duì)PLA801D細(xì)胞的增殖抑制率(，%)

表1 不同濃度欖香烯對(duì)PLA801D細(xì)胞的增殖抑制率(，%)

組別 A值 抑制率(%) P值1.39±0.11 － －20 μg/ml組 1.12±0.18 19.5 ﹤0.01 40 μg/ml組 0.93±0.15 33.1 ﹤0.01 80 μg/ml組 0.84±0.21 39.6 ﹤0.01聯(lián)合組 0.71±0.22 49.2 ﹤0.01對(duì)照組

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果 單純欖香烯組隨著藥物濃度增加細(xì)胞周期進(jìn)程變化明顯，尤其是聯(lián)合組變化顯著，證明氯丙嗪可促進(jìn)欖香烯的藥代動(dòng)力學(xué)作用，具有較強(qiáng)的增敏效應(yīng)。見(jiàn)表2。

表2 不同組別對(duì)PLA801D細(xì)胞周期進(jìn)程的影響(，%)

表2 不同組別對(duì)PLA801D細(xì)胞周期進(jìn)程的影響(，%)

59.4±2.4 35.9±1.3 4.6±1.7 0.5 20 μg/ml組 52.3 ±3.1 43.9 ±1.7 9.6 ±0.8 6.2 40 μg/ml組 40.2 ±2.6 39.9 ±1.8 16.6 ±1.4 9.7 80 μg/ml組 35.3 ±2.1 46.6 ±1.6 18.1 ±2.3 13.0聯(lián)合組凋亡率對(duì)照組組別 G0/G1 S G2/M 26.3±2.1 52.7±2.7 20.9±3.2 17.5

3 討論

肺癌的耐藥性一直是影響其化療效果的一大難題。耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制非常復(fù)雜，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，不斷有新的觀點(diǎn)提出〔2〕，尤其是化療增敏劑的應(yīng)用，為肺癌多藥耐藥拮抗治療開(kāi)辟了新途徑。化療增敏劑是指沒(méi)有抗腫瘤作用，但能提高已知有抗腫瘤作用藥物的化療效果〔3〕，增強(qiáng)抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷或降低其對(duì)正常組織毒性的一類(lèi)藥物。氯丙嗪屬于吩噻嗪類(lèi)化合物，是一種鈣調(diào)蛋白抑制劑，與化療藥物作用后顯著改變化療藥物的藥代動(dòng)力學(xué)機(jī)制〔4〕，不僅能使藥物達(dá)到有效濃度，而且可減少藥物的毒副作用，葉欣等〔5〕報(bào)道鹽酸氯丙嗪具有體外逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥作用，但其協(xié)同欖香烯抗腫瘤作用的報(bào)道甚少。

本研究應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)不同濃度的欖香烯對(duì)PLA801D細(xì)胞增殖抑制均獲得較為滿意的結(jié)果，尤其是欖香烯聯(lián)合氯丙嗪對(duì)PLA801D細(xì)胞的抑制率達(dá)高于欖香烯80 μg/ml組，說(shuō)明氯丙嗪與欖香烯合用具有顯著的協(xié)同作用。

本研究還應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度的欖香烯對(duì)PLA801D細(xì)胞周期進(jìn)程的影響。結(jié)果顯示，G1/G0期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少G2/M期細(xì)胞相對(duì)增多。G1/G0期細(xì)胞又稱細(xì)胞復(fù)制前期，G1期是制造和產(chǎn)生rRNA、mRNA、tRNA及核蛋白體。細(xì)胞周期中的G1→S期是細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的交接點(diǎn)，已經(jīng)確認(rèn)為是細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，它能阻止細(xì)胞過(guò)度或無(wú)限制生長(zhǎng)。因此抑制細(xì)胞周期G1期的RNA及核蛋白體的合成，間接地使腫瘤細(xì)胞減少，尤其是聯(lián)合組作用更為顯著，抑制G1期向S期轉(zhuǎn)化進(jìn)程，從而使G2期細(xì)胞相對(duì)增多，而G2/M期細(xì)胞增多是細(xì)胞損傷的普遍反映〔6〕。這一點(diǎn)從細(xì)胞凋亡率上可得到證實(shí)。

綜上所述，欖香烯聯(lián)合氯丙嗪對(duì)PLA801D細(xì)胞增殖抑制有較強(qiáng)的協(xié)同作用，但其協(xié)同效應(yīng)機(jī)制目前還不十分清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

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