蔡亮亮，余方榮，李西海，葉蕻芝，徐慧鳳，劉獻祥*

1福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;2福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州 350108

龍須藤(Bauhinia championii Benth)又稱梅花入骨丹、九龍?zhí)?，系雙子葉植物豆科類羊蹄甲屬植物多年生藤［1］，具有祛風(fēng)除濕、行血氣之功效，主治跌打損傷，風(fēng)濕骨痛、心胃氣通［2］。主要分布在福建、廣東、江西等地，尤其在福建福州永泰縣青云山地區(qū)資源豐富。龍須藤多糖是龍須藤的主要有效成分之一，在治療骨性關(guān)節(jié)炎方面具有較高的應(yīng)用開發(fā)價值;影響多糖的提取率因素很多，其中，提取溫度、提取時間、料液比、提取次數(shù)是主要因素。響應(yīng)曲面法是評價指標(biāo)和因素間的非線性關(guān)系的一種試驗設(shè)計方法，其原理是通過一些列確定性試驗擬合為一個響應(yīng)面來模擬真實的極限狀態(tài)曲面，從而很容易的進行可靠性分析［3］。目前多種植物多糖用響應(yīng)曲面法進行測定，都能得到較高的提取率［4-6］，因此，本文在單因素試驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合響應(yīng)曲面法，對龍須藤多糖的提取工藝進行優(yōu)化，以期為龍須藤多糖的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

LXJ-低速大容量多管離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)，DU-640紫外可見分光光度計(美國Beckman公司)。D-無水葡萄糖對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110833-200904)，無水乙醇、苯酚、濃硫酸(分析純);龍須藤經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊成梓副教授鑒定。

1.2 方法

1.2.1 龍須藤多糖的提取

精密稱取粉碎干燥后的龍須藤粉末5 g，石油醚脫脂并干燥，置圓底燒瓶中，按照設(shè)定好的條件(提取溫度、提取時間、料液比、提取次數(shù))進行回流提取，提取液趁熱抽濾，制備多糖水提液，將其濃縮并定容至50 mL。分別量取上述定容溶液10 mL置50 mL離心管中，加40 mL無水乙醇，搖勻，4℃醇沉過夜、離心，沉淀加水溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，定容。

1.2.2 龍須藤多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

根據(jù)苯酚-硫酸法［7］，精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg置100 mL容量瓶中水溶解并定容，制備100 μg/mL的溶液。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 置 7 個干燥具塞試管中，加蒸餾水使最終體積均為1 mL，搖勻，分別加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5 mL，充分搖勻沸水浴15 min，室溫冷卻15 min，于490 nm波長處測定吸光度。龍須藤多糖按照上述方法測定吸光度，計算多糖含量。

1.2.3 多糖提取率的計算

多糖提取率/% =多糖質(zhì)量/藥材質(zhì)量 ×100%

1.2.4 單因素試驗

固定提取時間3 h、料液比1∶25、提取2次的條件下，分別以60、70、80、90、100℃進行提取，考察提取溫度對多糖得率的影響。

固定溫度100℃、料液比1∶25、提取2次的條件下，分別提取2、3 、4 、5、6 h，考察提取時間對多糖得率的影響。

固定溫度100℃、提取時間3 h、提取2次的條件下，分別在料液比 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 的條件下提取，考察料液比對多糖得率的影響。

固定溫度100℃、提取時間3 h、料液比1∶25的條件下，分別提取1、2、3、4次，考察提取次數(shù)對多糖得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)曲面優(yōu)化法試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，每個單因素選取提取率比較高的3個水平，借助試驗設(shè)計軟件Design-Expert.8.05b，采用 Box-Behnken 設(shè)計法。因素編碼水平見表1。

表1 試驗因素水平編碼Table 1 Levels and factors of polysaccharides extraction test

2 結(jié)果

2.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按1.2.2項操作，得出各份溶液的吸光度值 ，以多糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得回歸方程:Y=0.0091X-0.0132，R=0.9989

2.2 單因素結(jié)果分析

2.2.1 提取溫度對龍須藤多糖得率的影響

精密稱取5份5 g的龍須藤，加入料液比為1∶25的水，提取2次，每次3 h，將溫度分別設(shè)定在60、70、80、90、100℃，研究溫度對龍須藤多糖提取率的影響，見圖1。

由圖1可知，在60-100℃溫度范圍內(nèi)，隨著提取溫度的升高，多糖得率顯著增加，升高到90℃，再提高溫度，多糖得率增加幅度較小，考慮到能耗及多糖在較高溫度下易降解，選擇90℃較適宜。

圖1 溫度對多糖提取率的影響Fig.1 Effects of temperature on the extraction rate of polysaccharide

2.2.2 提取時間對龍須藤多糖得率的影響

精密稱取5份5 g的龍須藤，加入料液比為1∶25的水，100℃、提取2次的情況下，將時間設(shè)定在2、3、4、5、6 h，研究時間對龍須藤多糖提取率的影響，見圖2。

由圖2可知，在2～3 h之間，隨著提取時間的延長，多糖得率顯著增加，3～5 h之間多糖得率增幅較小，在提取5 h后，多糖得率反而下降，提取時間的延長，其它成分也被提取出來，因此提取時間選擇3 h較合適。

圖2 提取時間對多糖提取率的影響Fig.2 Effects of extraction time on the extraction rate of polysaccharide

2.2.3 料液比對龍須藤多糖得率的影響

精密稱取5份5 g的龍須藤，100℃、提取2次、每次 3 h、將料液比設(shè)定在 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，研究料液比對龍須藤多糖提取率的影響，見圖3。

由圖3可知，在料液比較低時隨著料液比的增大，多糖得率也在增大，料液比在1∶25時多糖得率最高，料液比超過1∶25時，多糖得率反而下降;這是由于增大料液比可以使物料與溶劑接觸面積增大，使多糖被充分的提取出來，但料液比過大，也使其它成分被過多溶出，消耗能量與時間，因此，料液比為1∶25時較為合適。

圖3 料液比對多糖提取率的影響Fig.3 Effects of ratio of material to solvent on the extraction rate of polysaccharide

2.2.4 提取次數(shù)對龍須藤多糖得率的影響

精密稱取5份5 g的龍須藤，加入料液比為1∶25 的水，100 ℃提取3 h;提取1、2、3、4 次，研究提取次數(shù)對龍須藤多糖提取率的影響，見圖4。

由圖4可知，在提取3次時，多糖得率較高，考慮到提取成本，因此選擇提取3次較為合適。

2.3 響應(yīng)曲面實驗

圖4 提取次數(shù)對多糖提取率的影響Fig.4 Effects of extraction times on the extraction rate of polysaccharide

2.3.1 采用Box-Behnken設(shè)計，以提取溫度、提取時間、料液比、提取次數(shù)為自變量，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面試驗，實驗設(shè)計與結(jié)果見表2利用Design-Expert.8.05b軟件對數(shù)據(jù)進行分析，得二元多項回歸方程:Y=2.42+0.34A+0.27B-0.078C+0.24D+0.29AB-0.31AC-0.1AD-0.053BC-0.23BD+0.07CD-0.078A2-0.18B2-0.72C2+0.079D2。從表3可以看出模型的一次項提取溫度是極顯著的(P＜0.0001)，一次項提取時間(P=0.0002 ＜0.001)是極顯著的，提取次數(shù)(P=0.0005＜0.001)是極顯著的。交叉相中溫度與時間(P=0.0063 ＜0.01)、溫度與料液比(P=0.0036 ＜0.01)是高度顯著的、時間與次數(shù)(P=0.026＜0.05)是顯著的。二次項中提取時間(P=0.021＜0.05)是顯著的，提取料液比(P＜0.0001)是極顯著的，表明各個影響因素不是線性關(guān)系。整體模型的 P＜0.0001，表明二次方程模型顯著，模型的失擬項P值為0.3922，大于0.05，說明模型選擇合適，并且該模型的總回歸系數(shù)為R2=94.43，說明該模型與實際試驗擬合較好，可用于龍須藤多糖水浸提實驗的理論預(yù)測。

表2 Box-Behnken設(shè)計實驗結(jié)果Table 2 Box-Behnken experiment design and the results

10 -1 0 0 -1 1.96 1.74 11 0 0 1 -1 1.29 1.23 12 0 0 0 0 2.19 2.42 13 1 1 0 0 2.95 3.06 14 0 0 0 0 2.47 2.42 15 -1 0 1 0 1.46 1.52 16 -1 0 -1 0 1.09 1.04 17 -1 0 0 1 2.58 2.42 18 0 1 0 1 2.69 2.60 19 0 1 -1 0 1.98 1.91 20 1 0 1 0 1.64 1.57 21 0 0 0 0 2.62 2.42 22 0 -1 -1 0 1.39 1.28 23 1 -1 0 0 1.93 1.95 24 0 0 1 1 2.03 2.01 25 0 1 0 -1 2.73 2.57 26 0 -1 0 1 2.47 2.51 27 1 0 0 1 2.81 2.90 28 0 -1 0 -1 1.61 1.59 29 -1 -1 0 0 1.71 1.84

表3 回歸分析結(jié)果Table 3 Results of regression analysis

2.3.2 響應(yīng)曲面及等高線分析

圖5-10是根據(jù)回歸模型作出的相應(yīng)的等高線與響應(yīng)面，顯示了不同的交叉因素對多糖得率的影響。等高線圖上圓形表示交互作用不明顯，曲率半徑較大的橢圓則表示交互作用顯著，并且曲率半徑越大交互作用越顯著;在等高線圖上，在最大的橢圓上取值，多糖得率最低，在最小的橢圓上取值，則表示多糖得率最高，它們之間的等高線反映了多糖得率的變化;響應(yīng)面的最高點同時也是等高線最小橢圓的中心點［8］。由表3知各因素對多糖提取率的影響因素為:提取溫度與料液比＞提取溫度與提取時間＞提取時間與提取次數(shù)＞料液比與提取次數(shù)＞提取時間與料液比。

3 結(jié)論

本實驗運用近幾年發(fā)展起來的分析方法-響應(yīng)曲面法對龍須藤多糖的提取工藝進行優(yōu)化，通過此分析方法建立了水浸提龍須藤多糖的二次多項式模型，對影響多糖提取率的因素及其交互作用進行探討。由 Design-Expert.8.0.5b軟件分析處理，確定龍須藤多糖提取的最佳工藝為:提取溫度100℃、提取時間4 h、料液比為1∶23.2、提取次數(shù)為2次，考慮到實際的操作條件，將龍須藤多糖的提取條件修改為:提取溫度100℃、提取時間4 h、料液比為1∶23、提取次數(shù)為2次，理論計算提取率為3.12%，在此基礎(chǔ)上驗證，提取率為2.98%，與預(yù)測值比較接近;此實驗優(yōu)選出龍須藤多糖的提取實驗條件，可以為龍須藤藥材開發(fā)、質(zhì)量控制提供實驗基礎(chǔ)。

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