史敏娟，熊雙麗，盧 飛，王瑩瑩

(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽621010)

雞胸軟骨硫酸軟骨素的制備及其穩(wěn)定性研究

史敏娟，熊雙麗*，盧 飛，王瑩瑩

(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽621010)

采用木瓜蛋白酶水解法從雞胸軟骨中提取硫酸軟骨素粗多糖，并用三氯乙酸除蛋白、乙醇沉淀和柱色譜分離純化得到高純度產(chǎn)品。以硫酸軟骨素主要成分(總糖、還原糖、葡萄糖醛酸、游離硫酸根)及相對黏度為指標(biāo)，研究熱、酸堿、氧化劑處理對硫酸軟骨素穩(wěn)定性的影響及紫外光照射對其結(jié)構(gòu)的影響。研究結(jié)果表明，經(jīng)紫外光照射后，硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)基本無變化;在溫度低于80℃，pH=7時(shí)，硫酸軟骨素穩(wěn)定性較好。溫度大于100℃、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或含有氧化劑時(shí)，硫酸軟骨素極不穩(wěn)定，各成分變化程度較大，游離硫酸根增加，分子量降低。但對于其降解機(jī)理，需做進(jìn)一步研究。

硫酸軟骨素，制備，穩(wěn)定性，結(jié)構(gòu)

Abstract:The chicken sternal cartilage was hydrolyzed with papain.After protein was removed with trichloroacetic acid and ethanol precipitation，the crude chondroitin sulfate was purified with 732 anion chromatography and Sephacryl-300HR gel filtration chromatography in return.Then its stability with its total sugar，reducing sugar，glucuronic acid，free sulfate ions and the relative viscosity after heat，pH and oxidant treatment was studied.And its structure stability by infrared spectrum analysis after UV irradiation was studied.The results showed its basic structure had no change after UV irradiation，and it was relatively stable when temperature was lower than 80℃ and pH=7.The Chondroitin sulfate degraded when the temperature reached to 100℃，strong acid，alkaline or oxidant conditions，the ingredients varied in a wide range，the content of free sulfate ions increased and its molecular reduced.But it needed further study on its degradation mechanism.

Key words:chondroitin sulfate;preparation;stability;structure

硫酸軟骨素是由D-葡萄糖醛酸(GlcpA)與N-乙酰-D-氨基半乳糖(GalpA)交替連結(jié)而成的一類酸性糖胺聚糖［1］，主要存在于動(dòng)物喉骨、鼻中隔、氣管等軟骨組織中，相對分子質(zhì)量約為10000～50000u。硫酸軟骨素還具有抗凝、抗炎、抗血栓、抗癌，及降低心肌耗氧量，促進(jìn)冠狀動(dòng)脈循環(huán)，降脂、抗凝血和防止血管硬化等生物活性，可用來治療關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、牛皮癬，以及抑制泌尿系統(tǒng)結(jié)石等疾?。?-5］。硫酸軟骨素作為添加劑，目前已被廣泛應(yīng)用于功能性食品、藥品及化妝品，成為國內(nèi)外市場上重要的生化產(chǎn)品。近年來，從關(guān)于硫酸軟骨素構(gòu)效關(guān)系和改性的研究中發(fā)現(xiàn)，硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)的變化將導(dǎo)致生物活性的顯著變化。目前，關(guān)于硫酸軟骨素改性的研究主要集中在硫酸化硫酸軟骨素(polysulfate chondroitin sulfate，PSCS)及低分子多硫酸化硫酸軟骨素(low molecular weight polysulfate chondroitin sulfate)方面［6］，還有人將硫酸軟骨素與金屬離子如Na、Cu、Al等結(jié)合用來治療某些疾?。?］。但在硫酸軟骨素化學(xué)衍生物的制備過程中，除了目標(biāo)產(chǎn)物的形成，熱、酸堿、氧化劑等處理還會(huì)引起整個(gè)多糖的成分和結(jié)構(gòu)的顯著變化，但對于此方面的研究還相對較少。本實(shí)驗(yàn)現(xiàn)以硫酸軟骨素主要成分(總糖、還原糖、葡萄糖醛酸、游離硫酸根)及相對黏度為指標(biāo)，研究熱、酸堿、氧化劑處理對硫酸軟骨素穩(wěn)定性的影響及紫外光照射對其結(jié)構(gòu)的影響，為硫酸軟骨素的提取和各種改性提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

雞胸軟骨 成都新太豐農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司;木瓜蛋白酶 生化純;葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品、間羥基聯(lián)苯

Sigma公司;732#陽離子交換樹脂 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;Sephacryl-300HR Phamacia公司;其他試劑 均為分析純。

WFJ7200型可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 海亞榮生化儀器廠;HD-2紫外檢測儀 上海滬西儀器廠;紅外光譜儀Nicolet-5700 美國尼高力儀器公司;烏氏毛細(xì)管相對黏度計(jì)(?=0.5～0.6mm)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高純度硫酸軟骨素的提取、分離與純化［8］雞胸軟骨→木瓜蛋白酶水解(55℃，6h)→10%三氯乙酸除蛋白→抽濾、離心(4500r/min，10min)→50℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮→乙醇(四倍體積工業(yè)酒精)沉淀→冰箱放置過夜→離心收集沉淀(4500r/min，10min)→透析脫鹽→732#陽離子交換樹脂→Sephacryl-3000HR柱層析→冷凍真空干燥→純品、備用

1.2.2 不同處理對硫酸軟骨素穩(wěn)定性的影響 硫酸軟骨素中主要包含葡萄糖醛酸(GlcA)，氨基己糖和硫酸根［8］，因此，以總糖、葡萄糖醛酸、還原糖、游離硫酸根及其相對相對黏度作為分析硫酸軟骨素穩(wěn)定性的指標(biāo)。

1.2.2.1 分析方法 總糖:苯酚-硫酸法［9］;葡萄糖醛酸:間羥基聯(lián)苯法［8］;還原糖:3，5-二硝基水楊酸法［9］;游離硫酸根:氯化鋇-比濁法［10-11］;相對黏度:毛細(xì)管相對黏度計(jì)法(28℃)［12］。

1.2.2.2 溫度對硫酸軟骨素穩(wěn)定性的影響 用去離子水配制濃度為10mg/mL的硫酸軟骨素溶液，在pH=6.54 的條件下，分別于 50、60、70、80、90、100℃條件下恒溫水浴，每隔1h測定樣品溶液中總糖、葡萄糖醛酸、還原糖、游離硫酸根含量及其相對黏度。

1.2.2.3 pH對硫酸軟骨素穩(wěn)定性的影響 用去離子水配制配制濃度為10mg/mL的硫酸軟骨素水溶液，分別調(diào)節(jié) pH=1、3、5、7、9、11、13，在 80℃條件下恒溫水浴，每隔1h測定樣品溶液中總糖、葡萄糖醛酸、還原糖、游離硫酸根含量及其相對黏度。

1.2.2.4 氧化劑對硫酸軟骨素穩(wěn)定性的影響 分別用濃度為1.5%、2.5%、3.5%、4.5%的H2O2水溶液配制濃度為10mg/mL的硫酸軟骨素溶液，調(diào)節(jié)pH至中性，在80℃條件下恒溫水浴，每隔1h測定樣品溶液中總糖、葡萄糖醛酸、還原糖、游離硫酸根含量及其相對黏度。

1.2.2.5 紫外光照射對硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)的影響 用254nm波長的紫外光分別照射硫酸軟骨素干粉0、30、60、90min，紫外照射后，進(jìn)行紅外光譜分析，并與未經(jīng)紫外照射的雞胸硫酸軟骨素紅外圖譜比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸軟骨素得率及純度

高純度硫酸軟骨素的提取、分離與純化［8］實(shí)驗(yàn)得出，木瓜蛋白酶提取率為33.51% ±0.76%，硫酸軟骨素粗提物經(jīng)過三氯乙酸除蛋白、乙醇沉淀、離子交換和凝膠層析，可得到成分相對單一的硫酸軟骨素純品，純度高達(dá)99.09%。

2.2 不同處理對硫酸軟骨素穩(wěn)定性的影響

2.2.1 溫度對硫酸軟骨素穩(wěn)定性的影響 圖1～圖5表示在pH=6.54時(shí)，不同溫度、不同時(shí)間條件對硫酸軟骨素穩(wěn)定性的影響。

圖1 溫度對總糖含量的影響Fig.1 Effect of the temperature on the content of the total sugar

圖2 溫度對還原糖含量的影響Fig.2 Effect of the temperature on the content of the reducing sugar

圖3 溫度對葡萄糖醛酸含量的影響Fig.3 Effect of the temperature on the content of the glucuronic acid

圖4 溫度對游離硫酸根含量的影響Fig.4 Effect of the temperature on the content of the free sulfate ions

圖1和圖3顯示，硫酸軟骨素總糖含量低于葡萄糖醛酸含量，這是因?yàn)榭偺呛渴窃?90nm波長處測定，硫酸軟骨素中含有30%左右的葡萄糖醛酸和乙酰氨基半乳糖，而葡萄糖醛酸和氨基己糖的最大吸收均不在490nm，因此造成總糖含量測定偏低。

圖5 溫度對相對黏度的影響Fig.5 Effect of the temperature on the relative viscosity

由圖1～圖5可以看出，隨著溫度升高，時(shí)間延長，總糖含量逐漸下降，葡萄糖醛酸、還原糖和游離硫酸根含量逐漸上升，相對黏度也逐漸增大，但在100℃后開始減小。這些結(jié)果表明，硫酸軟骨素耐熱性較好，但超過100℃，耐熱性降低，其中硫酸基團(tuán)的熱穩(wěn)定性較差，而糖醛酸鍵的熱穩(wěn)定性則相對較好。這可能是由于多糖發(fā)生熱降解所致，大分子多糖降解成小分子多糖，還有部分多糖降解成單糖。這樣的影響主要與多糖的成分、熱處理的溫度和時(shí)間有關(guān)。以上結(jié)果表明，加熱溫度低于80℃，6h以內(nèi)硫酸軟骨素多糖具有相對理想的穩(wěn)定性。因此，對硫酸軟骨素的改性和加工最好控制在80℃范圍內(nèi)。

2.2.2 pH對硫酸軟骨素穩(wěn)定性的影響 圖6～圖10表示在80℃恒溫條件下，不同pH、不同時(shí)間條件對硫酸軟骨素穩(wěn)定性的影響。

圖6 pH對總糖含量的影響Fig.6 Effect of the pH on the content of the total sugar

圖7 pH對還原糖含量的影響Fig.7 Effect of the pH on the content of the reducing sugar

圖8 pH對葡萄糖醛酸含量的影響Fig.8 Effect of the pH on the content of the glucuronic acid

圖9 pH對游離硫酸根含量的影響Fig.9 Effect of the pH on the content of the free sulfate ions

圖10 pH對相對黏度的影響Fig.10 Effect of the pH on the stability relative viscosity

由圖6～圖10可以看出，隨著pH增大，時(shí)間延長，總糖和葡萄糖醛酸含量逐漸減少，游離硫酸根含量逐漸增大;在偏離中性條件下，偏離越多，還原糖含量減少，相對黏度降低，尤其在pH≤1和pH≥13條件下，隨著時(shí)間延長，還原糖含量和相對黏度急劇降低。這可能是由于在強(qiáng)堿條件下，還原糖被氧化，強(qiáng)酸條件下，多糖分子可能發(fā)生解聚，或者羧基被解離，分子帶有較多的負(fù)電荷，產(chǎn)生較大的靜電排斥力，使之不易聚集，因而聚集體顯著減小，從而導(dǎo)致溶液相對黏度降低［13］。同時(shí)，在pH≤1和pH≥13的強(qiáng)酸堿條件下，多糖的分子結(jié)構(gòu)也可能會(huì)發(fā)生變化?？傮w來說，在溫度為80℃、pH=7條件下，硫酸軟骨素穩(wěn)定性較好，因此可在80℃，中性環(huán)境條件下，對硫酸軟骨素進(jìn)行改性和加工利用。

2.2.3 氧化劑對硫酸軟骨素穩(wěn)定性影響 圖11～圖15表示在80℃恒溫條件下，不同濃度氧化劑、不同時(shí)間條件對硫酸軟骨素穩(wěn)定性的影響。

由圖11～圖15中可以看出，隨著氧化劑H2O2濃度增大，時(shí)間延長，硫酸軟骨素中總糖、還原糖、葡萄糖醛酸含量逐漸降低，游離硫酸根離子逐漸增多，溶液相對黏度逐漸減小，當(dāng)H2O2濃度4.5%時(shí)，還原糖在1h內(nèi)被氧化完全?？梢?，在氧化劑H2O2條件下，硫酸軟骨素多糖極不穩(wěn)定。這可能是由于在強(qiáng)氧化劑作用下，多糖分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變所致。葡萄糖醛酸顯色反應(yīng)中，顯色劑間羥基聯(lián)苯可能被氧化劑H2O2氧化成碳，溶液呈黑色，影響葡萄糖醛酸與間羥基聯(lián)苯反應(yīng)，導(dǎo)致糖醛酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏小。在氧化劑H2O2條件下，總糖含量增加，前3h高達(dá)50%左右，這可能是由于氧化劑的作用使多糖糖苷鍵發(fā)生斷裂，使大分子多糖降解為許多小分子多糖。

圖11 氧化劑對總糖含量的影響Fig.11 Effect of the oxidant on the content of the total sugar

圖12 氧化劑對還原糖含量的影響Fig.12 Effect of the oxidant on the content of the reducing sugar

圖13 氧化劑對葡萄糖醛酸含量的影響Fig.13 Effect of the oxidant on the content of the glucuronic acid

圖14 氧化劑對游離硫酸根含量的影響Fig.14 Effect of the oxidant on the content of the free sulfate ions

2.3 紫外光對硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)的影響

圖15 氧化劑對相對黏度的影響Fig.15 Effect of the oxidant on the relative viscosity

圖16 紫外光照射不同時(shí)間后雞胸硫酸軟骨素的紅外光譜圖Fig.16 Infrared spectrum of chondroitin sulfate from chicken sternal after different UV irradiation time

圖16為紫外光(254nm)照射0、30、60、90min 后雞胸硫酸軟骨素紅外光譜圖。比較圖譜發(fā)現(xiàn)，在3200～3600、2800～3000、1650、1556、1375～1420、1238～1256和855.25cm-1處出現(xiàn)的雞胸硫酸軟骨素的特征吸收峰基本無變化，紫外光照射后的雞胸硫酸軟骨素紅外光譜與熊雙麗等［14］報(bào)道的雞胸硫酸軟骨素紅外光譜吸收曲線基本一致。說明雞胸硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)對紫外光不敏感，經(jīng)過紫外光處理后的雞胸硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)基本無變化。

3 結(jié)論

通過酶提醇沉柱分離的方法從雞胸軟骨中可以分離得到純度較高的硫酸軟骨素，純度高達(dá)99.09%。以硫酸軟骨素的主要成分(總糖、還原糖、葡萄糖醛酸、游離硫酸根)及相對黏度為指標(biāo)，研究在不同溫度、酸堿、氧化劑濃度條件下硫酸軟骨素穩(wěn)定性的影響及紫外光照射對其結(jié)構(gòu)影響。其中相對黏度可以間接反映分子量大小，生物活性多糖的生物活性往往與其分子量密切相關(guān)。研究結(jié)果表明，254nm波長的紫外光照射對硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)基本無影響;處理溫度、pH和氧化劑都對硫酸軟骨素多糖產(chǎn)生一定影響。加熱溫度低于80℃、pH=7的中性條件下，總糖含量16%、葡萄糖醛酸含量25%左右，游離硫酸根含量低于1%，表明此條件下，硫酸軟骨素穩(wěn)定性相對較好，可在此條件下對硫酸軟骨素進(jìn)行改性和加工利用。溫度大于100℃，隨著時(shí)間的延長，葡萄糖醛酸和游離硫酸根含量增加，相對黏度減小;pH≤1和pH≥13的強(qiáng)酸、堿條件下，總糖含量相對不變，游離硫酸根含量增加，還原糖含量和相對黏度降低，表明此條件下硫酸軟骨素極不穩(wěn)定，會(huì)發(fā)生一定程度降解，導(dǎo)致硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)發(fā)生變化;氧化劑條件下，硫酸軟骨素總糖含量高達(dá)50%左右，表明氧化劑可引起多糖糖苷鍵發(fā)生斷裂，使多糖分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

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Preparation and stability study of chondroitin sulfate from chicken sternal cartilage

SHI Min-juan，XIONG Shuang-li*，LU Fei，WANG Ying-ying
(College of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，China)

TS251.1

B

1002-0306(2012)12-0328-05

2011-10-14 *通訊聯(lián)系人

史敏娟(1987-)，女，碩士研究生，研究方向:食品應(yīng)用化學(xué)。

綿陽市科技局項(xiàng)目(10Y004-1)。