劉琳琳 (山東醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，臨沂276002)

空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)是禽類腸道正常寄生菌，也是散發(fā)性細(xì)菌胃腸炎最常見的菌種。在發(fā)展中國家，空腸彎曲菌更是兒童腹瀉死亡的重要病原。且該菌與格林巴利綜合征有密切關(guān)系［1］。疫苗接種是預(yù)防其感染的有效途徑。

近年來，空腸彎曲菌疫苗主要包括滅活疫苗、減毒活疫苗和亞單位疫苗等，卻因不同血清型C．jejuni抗原分子結(jié)構(gòu)差異，或潛在的周圍神經(jīng)免疫性損傷等原因，使其相關(guān)研究未獲更多進(jìn)展［2］。DNA疫苗為克服這些障礙提供了希望［3］。

本研究取空腸彎曲菌PEB1抗原基因和以大腸埃希菌不耐熱腸毒素LTB基因作為粘膜佐劑，構(gòu)建PEB1-LTB融合DNA疫苗，經(jīng)鼻粘膜免疫BALB/c小鼠，分析其免疫活性初步探討粘膜佐劑LTB對(duì)空腸彎曲菌PEB1誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的輔助作用，為空腸彎曲菌疫苗初步研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1材料

1．1．1 菌株、質(zhì)粒、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 空腸彎曲菌購自CDC(中國疾病預(yù)防控制中心);質(zhì)粒pcDNA3．1(-)購自Invitrogen公司;大腸埃希菌(E．coli)JM109、人宮頸癌細(xì)胞系(Hela)為本實(shí)驗(yàn)室保存;4～6周清潔級(jí)BALB/c小鼠購自山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1．1．2 試劑 限制性內(nèi)切酶 EcoR I、XhoⅠ、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、pfu DNA聚合酶、小鼠細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4檢測(cè)試劑盒購于TaKaRa;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM2000購自Invitrogen;HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體、生物素化羊抗鼠IgA、DNA marker(DL2000 plus)購自北京Trans-Gen;HRP標(biāo)記親和素購自北京華美生物工程有限公司;引物由上海賽百盛生物技術(shù)有限公司合成;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1．2 方法

1．2．1 PCR擴(kuò)增基因片段 根據(jù)GeneBank公布PEB1、LTB序列及實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計(jì)引物。

以 C．jejuni總 DNA、E．coli全菌 DNA 為模板，P1、P2(PEB1);P3、P4(LTB)引物 PCR 擴(kuò)增，獲得PEB1和LTB基因片段，反應(yīng)條件:94℃ 10分鐘，94℃ 30秒，65℃/60℃ 30秒，72℃ 60秒，30個(gè)循環(huán)，72℃ 10分鐘。產(chǎn)物回收純化。重疊延伸PCR反應(yīng)，P5、P6為引物，獲得PEB-LTB融合基因片段。反應(yīng)條件:95℃ 1分鐘，50℃ 1分鐘，70℃ 1．5分鐘，5個(gè)循環(huán)后，改變反應(yīng)條件:95℃ 1分鐘，60℃ 1分鐘，72℃ 1．5分鐘，72℃延伸10分鐘，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。

1．2．2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及在Hela細(xì)胞中表達(dá) 融合基因PCR產(chǎn)物與pcDNA3．1(-)質(zhì)粒以EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收純化產(chǎn)物，連接過夜。轉(zhuǎn)化E．coli JM109，雙酶切鑒定，篩選陽性菌落。

脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000、重組載體 pcDNA3．1(-)-PEB-LTB與Hela細(xì)胞共同培養(yǎng)36小時(shí)后收集細(xì)胞，細(xì)胞裂解產(chǎn)物經(jīng)12%SDS-PAGE膠電泳，Western blot，鑒定蛋白表達(dá)。

1．2．3 DNA疫苗的制備及粘膜免疫接種 制備大量 DNA 疫苗［4］。PBS 稀釋至 1 μg/μl。BALB/c 鼠64只隨機(jī)數(shù)字表均分，即PBS對(duì)照組(A組);空質(zhì)粒對(duì)照組 pcDNA3．1(-)(B 組);pcDNA3．1(-)-PEB1(C 組)、pcDNA3．1(-)-PEB1-LTB(D 組)。接種采取滴鼻粘膜免疫方式。每種質(zhì)粒20 μl/(只．次)，A組每次每只接種等體積PBS。

1．2．4 免疫小鼠標(biāo)本的采集 小鼠每周免疫一次，共4次。每組隨機(jī)抽取8只，末次免疫2周后采血，制備脾淋巴細(xì)胞懸液，0．5 ml含0．25%蛋白酶抑制劑的PBS溶液沖洗氣管和小腸粘膜，收集沖洗液測(cè)定血清IgG和IgA、sIgA抗體;脾細(xì)胞上清液用于IFN-γ和IL-4細(xì)胞因子測(cè)定。

1．2．5 ELISA 法測(cè)定血清 IgG C．jejuni裂解液至包被96孔板，待測(cè)血清1∶50稀釋;二抗HRP-羊抗鼠IgG 1∶1 000稀釋;鄰苯二胺(OPD)顯色測(cè)定OD490。

1．2．6 生物素-親和素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(BSAELISA)檢測(cè)血清IgA和粘膜沖洗液sIgA C．jejuni裂解液包被96孔酶標(biāo)板加入小鼠血清或粘膜沖洗液100 μl/孔，37℃ 1小時(shí)后加入生物素化羊抗鼠IgA 抗血清(1∶2 000)100 μl/孔，37℃ 1 小時(shí)，加入1∶2 000稀釋 HRP標(biāo)記親和素，OPD顯色測(cè)定OD490。

1．2．7 脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4的測(cè)定 96孔板中加入脾細(xì)胞懸液5×105/孔，伴刀豆球蛋白 A(ConA，5 μg/ml)50 μl/孔，空腸彎曲菌裂解液50 μl/孔，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，收集上清，檢測(cè) IFN-γ、IL-4。

1．2．8 攻擊試驗(yàn) 每組剩余8只小鼠，末次免疫后第4周，分別于第1、3、7天以相同劑量(1 ml/只)，以C．jejuni(5×109CFU)灌胃攻擊。攻擊后每日觀察動(dòng)物發(fā)病及死亡情況，計(jì)算每組疾病指數(shù)(評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):外表健康為0分;生病為1分;死亡為2分)，直至末次免疫后第8周。小鼠出現(xiàn)背部聳起、皮毛變卷、脫色、毛色灰暗和/神萎中任何一項(xiàng)或幾項(xiàng)視為生?。?］。以各組疾病指數(shù)之和除以當(dāng)日被觀察動(dòng)物數(shù)得該組疾病指數(shù)，根據(jù)以下公式計(jì)算疫苗保護(hù)率。疫苗保護(hù)率=(對(duì)照組疾病指數(shù)-免疫組疾病指數(shù))/對(duì)照組疾病指數(shù)×100%。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。各組間抗體和細(xì)胞因子水平比較用單因素方差分析，P＜0．05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 目的基因擴(kuò)增 從 C．jejuni和 E．coli基因組DNA中分別擴(kuò)增出約780、370 bp產(chǎn)物(圖1)，重疊PCR擴(kuò)增獲得1 180 bp左右的重組基因PEB1-LTB(圖1)。

2．2 重組質(zhì)粒 pcDNA3．1(-)-PEB1-LTB鑒定 重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，產(chǎn)生1 180 bp和5 400 bp左右片段(圖1)，證明重組成功。

2．3 重組質(zhì)粒的表達(dá) 脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，Western blot證實(shí)，43 kD處出現(xiàn)明顯的蛋白條帶(圖2)。

2．4 小鼠血清IgG和IgA以及粘膜沖洗液sIgA水平 末次免疫后2周取血，D組中IgG、IgA抗體水平及氣管、小腸粘膜沖洗液sIgA抗體水平平均顯著高于其他各組(均P＜0．01)，C組IgG、IgA抗體水平及sIgA抗體水平顯著高于A、B組(均P＜0．01)。見表1。

2．5 小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子測(cè)定 末次免疫2周后，D組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4水平均顯著高于其他各組(P＜0．05，表2)。C組IFN-γ、IL-4水平顯著高于 A、B 組(P ＜0．01)。A、B和C組IL-4水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05，見表2)。

2．6 疫苗的臨床保護(hù)效應(yīng) 經(jīng)空腸彎曲菌重復(fù)攻擊后，D組疾病指數(shù)明顯低于其他各組(P＜0．01)。攻擊8周后，經(jīng)重組DNA疫苗pcDNA3．1(-)-PEB1-LTB免疫組小鼠幾乎均恢復(fù)正常，疫苗有效率高達(dá)92．95%。見表 3。

圖1 pcDNA3．1(-)-PEB1-LTB的酶切和PCR鑒定Fig．1 Restrication indentification of pcDNA3．1(-)-PEB1-LTB and PCR analysisNote:1．PCR product of PEB1 PCR;2．PCR product of LTB;M．DNA marker(DL2000 plus);3．pcDNA3．1(-)-PEB1-LTB digested by EcoR I and XhoⅠ;4．PCR product of recombination gene PEB1-LTB．

圖2 重組PEB1-LTB融合蛋白的Western blot分析Fig．2 Western blot analysis of recombinant PEB1-LTB fusion proteinNote:1．pcDNA3．1(-);2．pcDNA3．1(-)-PEB-LTB．

表2 小鼠脾細(xì)胞上清中IFN-γ和IL-4水平±s)Tab．2 Levels of IFN-γ and IL-4 in splenocyte culture supernatants from immunized mice(±s)

表2 小鼠脾細(xì)胞上清中IFN-γ和IL-4水平±s)Tab．2 Levels of IFN-γ and IL-4 in splenocyte culture supernatants from immunized mice(±s)

Note:Compared with other groups，1)P ＜0．01;compared with groups A and B，2)P ＜0．01．

Groups IFN-γ(pg/ml) IL-4(pg/ml)37±4 33±3 Group B［pcDNA3．1(-)］ 40±1 45±7 Group C［pcDNA3．1(-)-PEB1］ 1 273 ±802) 50 ±9 Group D［pcDNA3．1(-)-PEB1-LTB］ 2 021±2561) 224±351)Group A(PBS)

表1 小鼠血清抗體IgG、IgA以及粘膜沖洗液sIgA水平±s)Tab．1 Specific antibodies of IgG and IgA in the sera and sIgA in the mucosa douche of mice±s)

表1 小鼠血清抗體IgG、IgA以及粘膜沖洗液sIgA水平±s)Tab．1 Specific antibodies of IgG and IgA in the sera and sIgA in the mucosa douche of mice±s)

Note:Compared with groups A and B，1)P ＜0．01;compared with group C，2)P ＜0．01．

A490 value IgG IgA sIgA Group A(PBS)Groups 0．092 ±0．015 0．279 ±0．036 0．129 ±0．016 Group B［pcDNA3．1(-)］ 0．137 ±0．030 0．263 ±0．019 0．361 ±0．028 Group C［pcDNA3．1(-)-PEB1］ 0．410 ±0．0601) 0．712 ±0．1401) 0．513 ±0．0911)Group D［pcDNA3．1(-)-PEB1-LTB］ 0．636 ±0．1011)2) 1．092 ±0．1451)2) 0．889 ±0．1651)2)

表3 DNA疫苗免疫后的保護(hù)率Tab．3 Protective efficacy of DNA vaccines

3 討論

空腸彎曲菌是腹瀉常見病原菌，其發(fā)生率僅次于志賀菌所致的痢疾。人類主要通過糞-口途徑感染。粘膜抗菌感染免疫在抗該菌感染中起重要作用［6］。增強(qiáng)機(jī)體粘膜免疫可以有效預(yù)防空腸彎曲菌的感染。DNA疫苗經(jīng)粘膜免疫后，能有效地激活B細(xì)胞分泌sIgA，通過封閉細(xì)菌表面上皮細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)、中和細(xì)菌毒素、滅活細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌等機(jī)制發(fā)揮重要免疫屏障作用［7］。本研究構(gòu)建了基因重組DNA疫苗，采用粘膜免疫增強(qiáng)小鼠對(duì)空腸彎曲菌的免疫力，并研究了該 DNA疫苗誘導(dǎo)小鼠的免疫應(yīng)答水平。

LT是腸產(chǎn)毒型大腸埃希菌分泌并保存于菌體周質(zhì)中的一種外毒素，其B亞基(LTB)具有較強(qiáng)的免疫佐劑活性且無毒性，能有效增強(qiáng)局部粘膜的細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)Th1/Th2反應(yīng)的平衡，并促進(jìn)IgG型的轉(zhuǎn)化和sIgA的分泌［8］。

空腸彎曲菌外膜蛋白PEB1，基因序列相對(duì)保守，在不同血清型空腸彎曲菌中均有表達(dá)，是一種有效保護(hù)性抗原［9］?？漳c彎曲菌 PEB1基因制備的DNA疫苗能夠有效地誘導(dǎo) T細(xì)胞活化增殖［5，10］。但國內(nèi)尚無空腸彎曲菌融合DNA疫苗的研究報(bào)道。

本研究構(gòu)建了PEB1-LTB融合基因。構(gòu)建所得重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3．1(-)PEB-LTB，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞表達(dá)，Western blot分析，相對(duì)分子質(zhì)量為43 kD，ELISA試驗(yàn)呈現(xiàn)陽性，證實(shí)構(gòu)建的PEB1-LTB DNA疫苗能表達(dá)具有相應(yīng)免疫原性蛋白。

DNA疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠，結(jié)果顯示，小鼠產(chǎn)生的IgG、IgA抗體及氣管、小腸粘膜沖洗液sIgA抗體水平平均顯著高于其他各組(P＜0．01)，說明疫苗經(jīng)粘膜免疫小鼠，能誘發(fā)特異性體液免疫應(yīng)答，而粘膜佐劑LTB能輔佐PEB1誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更強(qiáng)的粘膜免疫應(yīng)答:末次免疫2周后，D組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4水平均顯著高于其他各組(均 P＜0．05)。C組 IFN-γ水平升高，IL-4水平未發(fā)現(xiàn)顯著增加。重組DNA疫苗免疫小鼠后可激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，聯(lián)合粘膜佐劑調(diào)節(jié)Th1/Th2反應(yīng)的平衡。

實(shí)驗(yàn)研究證明，重組PEB1-LTB DNA疫苗通過粘膜途徑免疫可獲得有效免疫保護(hù)性。小鼠攻擊實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)小鼠的保護(hù)率達(dá)92．95%。該研究為經(jīng)粘膜途徑感染病原體的疫苗研制進(jìn)行有益探索，為臨床應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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