李 俊 傅恩賜 許愛華 陳華圣 (揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州225001)

銀杏外種皮提取物(Ginkgo biloba exocarp extracts，GBEE)的主要成分是蛋白多糖，具有較好的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用［1-3］。本文研究GBEE對荷瘤小鼠 IL-2、IL-12、TNF-α 及 TGF-α 水平的影響，以探討其可能的抗腫瘤作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及瘤株 C57BL/6J小鼠及ICR小鼠，6～7周齡，18～22克，雌雄兼用，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供［動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(蘇)2007-0001］。S180腫瘤細(xì)胞，由中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所提供。

1.2 GBEE的制備 按發(fā)明專利方法(專利號(hào):201010251050.9)用水煮乙醇沉淀法制備銀杏外種皮提取物(GBEE)，采用高效液相色譜法對GBEE進(jìn)行定性分析，提示不含單糖;采用紅外光譜分析顯示其含有糖苷鍵及多糖吸收特征峰，提示GBEE主要成分為蛋白多糖，并經(jīng)薄層層析法測得其多糖由葡萄糖、果糖、半乳糖及鼠李糖等單糖鏈接而成;采用苯酚硫酸法及考馬斯亮藍(lán)法分別檢測GBEE的多糖及蛋白含量，二者之和即為GBEE中蛋白多糖含量，經(jīng)檢測，本研究所用GBEE蛋白多糖含量為66.4%。

1.3 主要試劑 小鼠IL-12及TNF-α定量酶聯(lián)檢測試劑盒由上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司提供;碘［125I］轉(zhuǎn)化生長因子 α(TGF-α)放射免疫分析藥盒由北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司提供;新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料公司;RPMI1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、刀豆蛋白A(ConA)及脂多糖(LPS)均為美國Sigma公司產(chǎn)品;注射用5-氟尿嘧啶(5-Fu，批號(hào)為1007042)購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 造模、分組及給藥 取ICR小鼠，常規(guī)局部消毒后無菌環(huán)境下于每只小鼠的右前肢腋下方皮下注射 S180 細(xì)胞懸液0.2 ml，細(xì)胞濃度為5 ×107ml－1，建立S180移植瘤模型，接種24小時(shí)后將小鼠隨機(jī)分為模型對照組、陽性對照組以及GBEE治療組，另設(shè)不接種腫瘤的正常對照組，每組小鼠皆為10只。正常對照組及模型對照組灌胃(ig)生理鹽水(NS);陽性對照組ig 5-Fu 25 mg/(kg·d);治療組分別ig GBEE 50、100 和200 mg/(kg·d)。皆每日1 次，連續(xù)給藥16天。第17天進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測。

1.5 腫瘤抑制率的計(jì)算 放血處死小鼠，剝?nèi)×鰤K并稱重，按以下公式計(jì)算腫瘤抑制率。抑瘤率(%)=(模型組平均瘤重－給藥組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%。

1.6 細(xì)胞因子檢測

1.6.1 TNF-α含量的檢測 小鼠摘眼球取血，分離血清，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定血清TNF-α含量，參考說明書步驟操作，于492 nm處檢測吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中TNF-α含量。

1.6.2 IL-12活性的檢測 放血處死小鼠，于無菌條件下取出脾臟，常規(guī)方法制備脾細(xì)胞懸液，溶解紅細(xì)胞后用Hanks液洗滌，再用含5%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×107ml－1。分別取1 ml脾細(xì)胞懸液加入24孔培養(yǎng)板中，再加入適量LPS(終濃度為5 mg/L)，將培養(yǎng)板置于37℃，含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)24小時(shí)，收集上清，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定上清中IL-12含量，參考說明書步驟操作，于492 nm處檢測吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中IL-12含量。

1.6.3 IL-2活性的檢測 荷瘤小鼠脾細(xì)胞懸液制備及培養(yǎng)方法同1.6.2，在脾細(xì)胞懸液中加入Con A(終濃度為5 mg/L)，培養(yǎng)24小時(shí)后收集上清，即IL-2粗制品，置于 －20℃保存，待測活性。取C57BL/6J小鼠6只，按前述方法制備脾細(xì)胞懸液、計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度。分別取100 μl脾細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，將待測IL-2按1∶4稀釋后分別取100 μl加入培養(yǎng)板中，再加入亞適量ConA(終濃度為2.5 mg/L)，常規(guī)培養(yǎng)44小時(shí)后加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后取出并加入異丙醇，于492 nm處檢測OD值，其OD值高低與IL-2活性成正相關(guān)。

1.7 TGF-α含量的檢測 取血及分離血清方法同前，按照檢測試劑盒說明書采用放射免疫分析法測定血清TGF-α的含量。由自動(dòng)γ計(jì)數(shù)器預(yù)先編制程序，直接給出有關(guān)參數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品中TGF-α濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料用x±s表示，組間比較采用 F檢驗(yàn)及Dunnett-t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 GBEE對S180移植瘤抑瘤率的影響 結(jié)果顯示，GBEE 3個(gè)劑量組均可顯著抑制小鼠S180移植瘤的生長，與模型組、對照組比較具有極顯著性差異(表1)。

2.2 GBEE對荷瘤小鼠血清 TNF-α含量的影響 結(jié)果顯示，模型對照組小鼠血清TNF-α含量明顯低于正常對照組;GBEE 100、200 mg/(kg·d)兩個(gè)劑量組均可提高荷瘤小鼠血清TNF-α含量，與模型組比較具有顯著性差異(表2)。

表1 GBEE對S180移植瘤抑瘤率的影響(n=10，x±s)Tab.1 Influence of GBEE on S180 transplantable tumor inhibitory rate(n=10，x±s)

表2 GBEE對荷瘤小鼠血清TNF-α含量的影響(n=6，x±s)Tab.2 Influence of GBEE on serum content of TNF-α in tumor bearing mice(n=6，x±s)

表3 GBEE對荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-12含量和IL-2活性的影響(n=6，x±s)Tab.3 Influence of GBEE on serum content of IL-12 and activity of IL-2 from splenic lymphocytes in tumor bearing mice(n=6，x±s)

表4 GBEE對荷瘤小鼠血清TGF-α含量的影響(n=6，x±s)Tab.4 Influence of GBEE on serum contents of TGF-α in tumor bearing mice(n=6，x±s)

2.3 GBEE對荷瘤小鼠脾細(xì)胞IL-12含量和IL-2活性的影響 結(jié)果顯示，模型對照組小鼠脾細(xì)胞分泌IL-12顯著減少，T淋巴細(xì)胞IL-2活性也明顯受抑制，GBEE 3個(gè)治療組皆可明顯促進(jìn)荷瘤小鼠脾細(xì)胞分泌IL-12，并增強(qiáng)荷瘤小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞IL-2活性，皆具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

2.4 GBEE對荷瘤小鼠血清 TGF-α含量的影響 結(jié)果顯示，模型對照組小鼠血清TGF-α含量明顯升高，與正常對照組比較具有極顯著性差異;GBEE 3個(gè)劑量組均可顯著降低荷瘤小鼠血清中TGF-α的含量(表4)。

3 討論

TGF-α是一類多肽生長因子，可在多種腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)［4］，TGF-α與 EGFR結(jié)合可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，而過度增殖的腫瘤細(xì)胞又可分泌更多的TGF-α，使腫瘤細(xì)胞無限增殖、快速生長而不受機(jī)體控制。本研究結(jié)果顯示GBEE對S180移植性肉瘤的生長具有顯著抑制作用，在50～200 mg/(kg·d)劑量范圍內(nèi)，其抑制率與劑量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，在200 mg/(kg·d)劑量時(shí)其抑制率可達(dá)38.36%，與對照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GBEE在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí)可明顯降低荷瘤小鼠血清TGF-α水平，提示其抗腫瘤作用機(jī)制與其抑制癌細(xì)胞中TGF-α的高表達(dá)具有一定相關(guān)性。

調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫防御功能是腫瘤預(yù)防及綜合治療的重要環(huán)節(jié)。在機(jī)體抗腫瘤免疫防御中，T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫占有重要地位。T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2可刺激T細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，并增強(qiáng)其對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性，還能刺激單核細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞［5］。淋巴因子IL-12，又稱自然殺傷細(xì)胞刺激因子，既可增強(qiáng)NK細(xì)胞活性，也可通過增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞以及IFN-γ分泌性T細(xì)胞的功能而抑制腫瘤生長［6］。本研究結(jié)果顯示，GBEE三個(gè)給藥組脾細(xì)胞IL-2及IL-12誘生水平明顯高于荷瘤對照組，提示GBEE可通過改善荷瘤小鼠的免疫失衡狀態(tài)而提高機(jī)體的抗腫瘤能力。

TNF-α主要由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強(qiáng)的生物活性因子之一。同時(shí)，TNF-α也可通過抑制腫瘤血管生成等間接途徑影響腫瘤細(xì)胞生長，還可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡［7］。本研究結(jié)果顯示，GBEE中、高劑量灌胃給藥可明顯提高荷瘤小鼠血清中TNF-α含量，這對防癌、抗癌以及抗腫瘤轉(zhuǎn)移皆具有重要意義。

1 許愛華，陳華圣，孫步蟾.銀杏外種皮多糖對HL-60細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)研究［J］.中藥材，2004;27(5):361-362.

2 陳華圣，許愛華，王 翊 et al.銀杏外種皮多糖對免疫功能低下小鼠IL-2活性及sIL-2R的影響［J］.中藥藥理與臨床，2001;17(4):17-18.

3 吳 倩，許愛華，楊 茜 et al.銀杏外種皮提取物有效部位GBEE-2對胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡及其通路的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2011;22(3):270-273.

4 Keiji Kikuchi，Xiaohan Li，Yang Zheng et al.Invasion of breast cancer cells into collagen matrix requires TGF-α and Cdc42 signaling［J］.FEBS Letters，2011;585(2):286-290.

5 湯釗猷.現(xiàn)代腫瘤學(xué)［M］.上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社，2000:293-294.

6 Kiyokazu Kawabe，Daniel Lindsay，Manjit Braitch et al.IL-12 inhibits glucocorticoid-induced T cell apoptosis by inducing GMEB1 and activating PI3K/Akt pathway［J］.Immunobiology，2011;6:1-6.

7 Kruglov A A，Kuchmiy A，Grivennikov S I et al.Physiological functions of tumor necrosis factor and the consequences of its pathologic overexpression or blockade:Mouse models［J］.Cytokine ＆ Growth Factor Reviews，2008;19:231-244.