廖玉婷 葉 劍 李 青 張曉丹 齊 暉 李富榮

(暨南大學第二臨床醫(yī)學院(深圳市人民醫(yī)院)干細胞與細胞治療實驗室，深圳518020)

胰島移植是治愈糖尿病的潛在治療方法之一，但目前仍然面臨著供體不足和免疫排斥等難題。α1-抗胰蛋白酶(alpha 1-antitrypsin，AAT)是體內(nèi)的一種重要絲氨酸蛋白酶抑制劑。最近研究發(fā)現(xiàn)AAT有保護胰島細胞、抑制炎癥反應、抗凋亡和誘導特異性免疫耐受的作用。NIT-1細胞系是非肥胖糖尿病(Non-obese diabetic，NOD)小鼠來源的胰島β細胞系，能穩(wěn)定分泌胰島素，常作為細胞模型用于糖尿病的研究［1］。本研究旨在建立穩(wěn)定表達人AAT基因NIT-hAAT細胞系，并觀察hAAT在糖尿病細胞治療中對β細胞的免疫保護作用。

1 材料與方法

1．1 細胞株、實驗動物及主要試劑 攜帶人AAT基因的原核質(zhì)粒pBS-RSV-hAAT由美國華盛頓大學Andre Lieber教授惠贈。真核質(zhì)粒載體 pDsRed-N111和大腸桿菌DH-5α均由北京大學深圳研究生院盧智剛教授惠贈。小鼠胰島NIT-1細胞株(20-40代)由中山大學附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科的李芳萍主任惠贈，在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4到5周齡雄性BALB/c小鼠由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。

PCR試劑購自Fermentas公司;轉染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司;限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ、XhoⅠ、ApaLⅠ，連接酶及去磷酸化酶購自TaKaRa公司;質(zhì)粒提取及膠回收試劑盒購自Axygen公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及Western blot化學發(fā)光底物購自Thermo公司;人α1-抗胰蛋白酶抗體購自GeneTex公司;二抗山羊抗兔IgG購自SouthernBiotech公司;鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)購自ALEXIS公司;鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自Millipore公司;血糖試紙及血糖儀購自Lifescan公司。

1．2 實驗方法

1．2．1 引物設計 按hAAT編碼區(qū)的序列設計引物，帶有限制性內(nèi)切酶位點。上游引物 P1:5'-，斜 體 部 分 為BglⅡ酶切位點;下游引物P2:5'-ACTCGAGCTCCAGCTCAACCCTT-3'，斜體部分為Xho I酶切位點。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1．2．2 pDsRed-N111-hAAT重組真核質(zhì)粒的構建和鑒定 PCR擴增pBS-RSV-hAAT質(zhì)粒的hAAT基因，電泳純化回收。用BglⅡ和XhoⅠ雙酶切hAAT基因和 pDsRed-N111質(zhì)粒，經(jīng)去磷酸化酶后，在22℃連接1．5到2小時，轉化至DH5α感受態(tài)細胞。在卡那霉素(100 μg/ml)藥物篩選12到14小時，挑6個陽性單克隆進行搖菌、提取質(zhì)粒。以pDsRed-N111質(zhì)粒作為陰性對照，采用BglⅡ和XhoⅠ雙酶切及測序鑒定。

1．2．3 細胞轉染及 NIT-hAAT細胞系的建立ApaLⅠ酶切線性化處理pDsRed-N111-hAAT質(zhì)粒，切膠回收。NIT-1細胞培養(yǎng)到80%到90%融合度后，在脂質(zhì)體介導下進行質(zhì)粒轉染，以pDsRed-N111空載體作為對照組，具體轉染方法參照試劑盒說明。G418(濃度為350 μg/ml)進行篩選，每3天換一次液，篩選14天。挑取單克隆，在含175 μg/ml G418的DMEM進行細胞擴增培養(yǎng)，建立NIT-hAAT細胞系。

1．2．4 Western blot 裂解3×107個穩(wěn)定表達pD-sRed-N111-hAAT的NIT-1細胞，以pDsRed-N111質(zhì)粒轉染組作為空白對照，得到100 μl蛋白樣品進行蛋白印跡分析。具體的操作方法參照相關文獻［2-5］，選用的一抗?jié)舛认♂尡稊?shù)為1∶500，二抗則為 1∶1 000。

1．2．5 糖尿病模型小鼠的制備 70只BALB/c小鼠連續(xù)5天腹腔注射STZ 40 mg/kg。5天后禁食6到8小時，進行斷尾采血測血糖，血糖值連續(xù)2次≥250 mg/dl造模成功。將糖尿病模型小鼠隨機分為3組(每組22只):NIT-hAAT組、NIT組和糖尿病組(假手術組);另15只正常小鼠為正常對照組。

1．2．6 細胞移植 在小鼠成模第5天，水合氯醛麻醉小鼠、NIT-hAAT組和NIT組糖尿病小鼠分別在左腎包膜下移植1．5×107個NIT-hAAT細胞和NIT-1細胞;糖尿病組作為假移植組，手術操作同上，注射10 μl PBS 緩沖液。

1．2．7 檢測指標 血糖和生存期的檢測:術后第1到7天，每天對各組小鼠進行斷尾采血測血糖;術后第14到30天，每3天測血糖1次;第31到60天每周測血糖1次，每次隨機檢測5只小鼠，如果連續(xù)2次＜250 mg/dl，則定義為血糖正常。觀察記錄小鼠的生存期，檢測期間取樣處死的小鼠不計入統(tǒng)計資料。

ELISA 檢測胰島素水平:在術后第 3、7、14、28和42天，每組分別取3只小鼠進行心臟取血(處死)，離心分離血清，小鼠胰島素ELISA試劑盒檢測血清中胰島素水平，具體操作參照說明書進行。

RT-PCR檢測左腎中移植細胞的hAAT表達:在術后第7、14、28和42天，取NIT-hAAT組和NIT組3只小鼠的左腎在液氮中研磨，提取總mRNA，逆轉錄為cDNA后進行hAAT基因的PCR擴增。體外對NIT-hAAT細胞進行傳代培養(yǎng)，取1．5×107個第20代細胞、糖尿病組和正常組小鼠左腎作為對照。上游引物P1:5'-GTACCCTAAACCAGCCAGACAG-3';下游引物P2:5'-GCTTCATCATAGGGACCTTCAC-3'，反應條件參考參照相關文獻［2，6］。

病理學觀察:在術后第28天和42天各組處死2只受體鼠取左腎，在福爾馬林中固定24小時后，石蠟包埋，制成5 μm切片，HE染色觀察移植部位炎性細胞浸潤情況。

2 結果

2．1 重組真核質(zhì)粒pDsRed-N111-hAAT的構建及酶切鑒定 hAAT基因的約為1 350 bp，見圖1A。圖1B是BglⅡ和XhoⅠ雙酶切后的pDsRed-N111質(zhì)粒片段和hAAT基因片段，pDsRed-N111線性質(zhì)粒片段約為3 300 bp。PCR擴增和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定結果:6個菌落中有4個能得到正確的hAAT基因條帶和與預期大小相符的酶切片段，以pD-sRed-N111質(zhì)粒為對照的酶切鑒定圖譜見圖1C。

對重組真核質(zhì)粒pDsRed-N111-hAAT進行測序，結果表明，本實驗所得到的hAAT編碼區(qū)基因的核苷酸序列與Andre Lieber教授的相一致，插入位點正確。

2．2 NIT-hAAT細胞系的建立及鑒定 pDsRed-N111-hAAT轉染NIT-1細胞，以pDsRed-N111為空白對照。G418篩選14天后得到NIT-hAAT細胞系。Western blot顯示NIT-hAAT細胞中出現(xiàn)分子量約55 kD的條帶，對照細胞沒有陽性表達，見圖2。上述結果顯示所構建的表達載體在NIT-hAAT細胞中表達人AAT蛋白。

圖1 重組真核質(zhì)粒pDsRed-N111-hAAT的構建及酶切鑒定Fig．1 Construction and restriction enzyme digestion of recombinant eukaryotic plasmid pDsRed-N111-hAAT

圖2 NIT-hAAT細胞的Western blot分析Fig．2 Western blot result of NIT-hAAT cells

2．3 NIT-hAAT移植對糖尿病小鼠血糖和生存期的影響 NIT-hAAT組和NIT組受體鼠接收細胞移植后，3天后血糖明顯下降，見圖3。NIT-hAAT組小鼠血糖水平降至接近正常小鼠，而且維持35天后開始出現(xiàn)血糖逐漸升高，至56天近似糖尿病小鼠血糖水平。NIT組小鼠在移植14天后，小鼠血糖即開始持續(xù)升高，28天升至糖尿病小鼠水平。

對各實驗組小鼠60天生存期觀察，正常組小鼠全部存活，糖尿病組小鼠在30天前已全部死亡。NIT-hAAT組小鼠的生存率為40%，NIT組小鼠的生存率為10%。NIT-hAAT組小鼠的生存期較NIT組小鼠明顯延長(P＜0．01)，見圖4。

2．4 NIT-hAAT移植對胰島素水平的影響 對各實驗組小鼠血清胰島素水平檢測發(fā)現(xiàn)，NIT-hAAT組小鼠的胰島素水平在第3天至35天與正常組小鼠無明顯差異(P＞0．05)，42天后開始明顯低于正常組小鼠(P ＜0．05)，但仍然高于糖尿病組小鼠(P ＜0．05)。NIT組小鼠胰島素水平在第3天至14天時與正常組無明顯差異(P＞0．05)，28天后胰島素水平明顯下降，接近糖尿病組小鼠的水平(P＞0．05)，見圖5。

圖3 細胞移植后各組受體鼠的血糖變化(n=5)Fig．3 Blood glucose levels of diabetic mice after cell transplantation(n=5)

圖4 細胞移植后各組受體鼠的生存率變化(n=10)Fig．4 Survival time of diabetic mice after cell transplantation(n=10)

圖5 細胞移植后各組血清胰島素水平的比較(n=3)Fig．5 The serum insultin level of diabetic mice after cell transplantation(n=3)

圖6 RT-PCR檢測小鼠左腎的移植細胞hAAT表達量Fig．6 The hAAT expression of diabetic mice after cell transplantation by RT-PCR

2．5 NIT-hAAT細胞在體內(nèi)的表達情況 RT-PCR的電泳結果中，第20代的NIT-hAAT細胞依然能穩(wěn)定表達 hAAT，目的條帶約 366 bp，見圖 6。NIT-hAAT細胞移植后的5個時間點之間出現(xiàn)hAAT表達量逐漸減弱的趨勢，而糖尿病小鼠和正常小鼠的腎組織不表達hAAT。

2．6 病理學觀察 在移植后28天，對移植組小鼠的左腎進行HE染色，NIT-hAAT細胞和NIT-1細胞在鏡下的形態(tài)相似，其細胞大小不等、形態(tài)不一，細胞核漿比大于正常細胞。在NIT-hAAT組腎包膜下移植部位，有少量淋巴細胞、單核細胞浸潤，大部分移植細胞仍然存活，結構正常，只有炎癥反應。NIT組腎包膜下移植部位，見有明顯的炎性細胞浸潤，并呈現(xiàn)纖維化狀態(tài)，移植部位只有少量移植NIT-1細胞存在。移植42天時，NIT-hAAT組腎包膜下移植部位也出現(xiàn)大范圍炎性細胞浸潤，有部分細胞組織呈纖維化改變，但仍有移植細胞存在;NIT組小鼠的移植部位沒有見到移植細胞，主要呈纖維化狀態(tài)，見圖7。

圖7 細胞移植后各組小鼠左腎組織的病理HE染色(SP，×200)Fig．7 The pathological HE staining of left kidneys in diabetic mice after cell transplantation(SP，×200)

3 討論

自埃德蒙頓(Edmonton)方案之后，胰島細胞移植被認為是目前最有希望治愈Ⅰ型糖尿病的方法之一，但在臨床隨訪報告中顯示糖尿病患者接受移植5年后，胰島素停用率只有10%［7］。其主要的原因，一方面是受體對植入胰島的同種異體免疫排斥，另一方面是Ⅰ型糖尿病受體對胰島β細胞自身免疫攻擊導致疾病復發(fā)。

絲氨酸蛋白酶抑制劑是一個蛋白超家族，在多種動物和植物物種中均有發(fā)現(xiàn)，對絲氨酸蛋白酶有調(diào)控功能［8］。而AAT是最廣泛存在于動物血清中的絲氨酸蛋白酶抑制劑，能夠抑制體內(nèi)多種蛋白酶的活性;同時，還是一種抗炎癥的急性期反應物，能保護機體正常細胞和器官，維持機體內(nèi)環(huán)境的平衡［9］。但不同物種的AAT表達基因的數(shù)目不一，人AAT是由一條單基因編碼，其蛋白氨基酸序列有60%與鼠源的AAT相一致;而豚鼠、兔和大部分實驗小鼠的AAT是由3～5個基因序列控制編碼，具有多個蛋白亞型，其中BALB/c小鼠的AAT亞型有7個［8，10］。人和小鼠 AAT是同源蛋白，都作為自殺型抑制劑與目標絲氨酸蛋白酶形成1∶1的滅活復合物［10］。人AAT的第353個氨基酸位點是重要的反應中心位點，C57BL/6鼠的5個AAT亞型中有3個相應氨基酸位點與人AAT相一致。而這些亞型的反應中心位點差異，使其與絲氨酸蛋白酶形成共價復合物能力的不同［10，11］。在臨床上，hAAT治療因AAT缺失而引起的慢性阻塞性肺疾病，已經(jīng)有接近20年時間，具有顯著的安全記錄［9］。最新研究發(fā)現(xiàn)，hAAT用于胰島移植的實驗中，具有抗凋亡和誘導特異性免疫耐受的特性［6，12，13］。

本研究以NIT-1細胞系為研究平臺，構建能穩(wěn)定表達hAAT的胰島β細胞系(NIT-hAAT)，觀察移植細胞自身分泌的hAAT能否保護移植物免受免疫排斥的作用。體內(nèi)移植實驗結果顯示，NIT-1細胞在14天后即開始出現(xiàn)血糖上升和胰島素水平明顯下降，表明移植的NIT-1細胞很快出現(xiàn)免疫排斥反應，移植細胞失去胰島素分泌功能。而NIT-hAAT細胞在移植后能穩(wěn)定表達胰島素，維持血糖呈正常水平至35天，表明hAAT的表達可抑制受體鼠對移植NIT-1細胞的免疫排斥反應，顯著延長了移植細胞的存活時間，病理學也證實hAAT在28天時可明顯減輕炎性細胞的浸潤，但在42天時仍有炎性細胞浸潤。這與 Lewis等［6，12］研究結果相符，他們以hAAT作為同種異體移植的體外單一輔助治療劑，發(fā)現(xiàn)hAAT通過抑制白細胞分泌IL-8以及減少單核細胞趨化蛋白和細胞間粘附分子的表達，最終抑制中性粒細胞的轉移;與此同時，hAAT能抑制巨噬細胞的遷移，減少TNF-α和IL-1β的分泌和NK細胞和CD3+細胞的聚集，緩解了胰島移植的急性炎癥，延長細胞存活時間［6，14-16］。

從RT-PCR結果中看出，在移植后期NIT-hAAT細胞逐漸失去功能?？赡艿脑蚴牵浦布毎鹔AAT分泌量不足，隨著免疫排斥反應的發(fā)生，hAAT的表達量也隨之下降，因此，其難以發(fā)揮全身的免疫調(diào)節(jié)作用［17］，只能在移植細胞外周形成暫時性局部的免疫保護，難以長期抵抗全身性的免疫系統(tǒng)的攻擊作用。另一方面移植細胞表達的hAAT是人源的蛋白酶，雖人和鼠的AAT是同源蛋白，在鼠中也同樣發(fā)揮作用，但其局部結構的差異仍容易誘發(fā)小鼠對hAAT的免疫抵抗作用。Lewis等［12］發(fā)現(xiàn)受體鼠對外源的hAAT會產(chǎn)生抗體，其產(chǎn)生的時間與hAAT注射量和注射時間有關，它抑制hAAT的免疫保護作用，影響移植物的存活時間。在本研究中，我們證明了移植NIT-hAAT細胞由于可以分泌hAAT，對抑制的NIT-1細胞起到了免疫保護作用，但存在細胞表達的hAAT不能誘導免疫耐受的形成，仍然出現(xiàn)炎性反應，使移植的NIT-hAAT細胞發(fā)生凋亡。如何利用hAA的抗炎癥、抗凋亡能力和誘導免疫耐能力來保護移植的胰島細胞的分子作用機制仍需要進行深入研究。

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