詹文捷唐由之江偉梁麗娜馬群英李嬌祁鑫張蕓

兩種經(jīng)口給藥方法治療實(shí)驗(yàn)性小鼠脈絡(luò)膜新生血管的比較與評價(jià)

詹文捷1，2唐由之1江偉1梁麗娜1馬群英1李嬌1祁鑫3張蕓3

目的從藥效藥理學(xué)角度評價(jià)主動(dòng)口服給藥及灌胃給藥的異同，為今后兩種給藥方法的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法將氪激光誘導(dǎo)發(fā)生脈絡(luò)膜新生血管的C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組：灌胃治療組，灌水對照組，飲藥治療組，飲水對照組，以正常小鼠作正常對照，不做任何處理。觀察小鼠的一般情況，分別在治療后第7天，第14天，第28天，采用ELISA檢測外周血中的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量，并在治療后28 d用FFA檢查觀察脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）面積。結(jié)果治療過程中灌胃給藥小鼠較主動(dòng)口服給藥小鼠體重偏低，精神及活動(dòng)度稍差，毛色也較差；給藥后第7天，14天，灌胃治療組及飲藥治療組外周血的VEGF含量均低于相應(yīng)的對照組及正常組（P＜0.05），灌胃治療組和飲藥治療組之間比較無明顯差異（P=0.179）；治療后第28天行小鼠FFA檢查，灌胃治療組造影后期CNV滲漏面積明顯小于灌胃對照組（P=0.033），飲藥治療組也明顯小于飲水對照組（P=0.016），但2個(gè)治療組之間無明顯差異（P=0.701）。結(jié)論主動(dòng)口服給藥可以達(dá)到與灌胃給藥相似的治療結(jié)果，對體積小的動(dòng)物以及需要長期給藥的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，主動(dòng)口服給藥也是一種有效的給藥方法。

灌胃；主動(dòng)口服給藥；小鼠；脈絡(luò)膜新生血管

臨床上一些慢性疾病需要長期用藥治療，如高血壓、糖尿病、癌癥以及眼科的視網(wǎng)膜變性類疾病，因此相應(yīng)的動(dòng)物藥效藥理學(xué)研究也需要長期給藥觀察。經(jīng)口給藥是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藥理學(xué)最常見的給藥方法，灌胃法因其給藥劑量精確、可重復(fù)性強(qiáng)而被國內(nèi)大多數(shù)學(xué)者采用，但是該方法存在操作技術(shù)要求相對較高，對動(dòng)物刺激大、容易引起食管及胃損傷，甚至因?yàn)殚L期灌胃的應(yīng)激反應(yīng)影響觀察指標(biāo)等缺點(diǎn)，給研究者帶來一定困擾。隨著實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)的發(fā)展，近年來國外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用主動(dòng)口服給藥方法（將藥物加入飲用水或飼料中）逐漸增多，但是對不同經(jīng)口給藥途徑的比較和評價(jià)研究很少，國內(nèi)也未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究以實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管小鼠做為觀察對象，將外周血中的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量以及脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）面積作為評價(jià)指標(biāo)，比較主動(dòng)口服給藥及灌胃給藥的藥效藥理學(xué)差異，為今后2種給藥方法的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑

SPF級C57BL/6小鼠，雄性，體質(zhì)量20～23 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。VEGF ELISA試劑盒（由北京優(yōu)尼康生物科技有限公司提供），鹽酸氯胺酮注射液（福建古田藥業(yè)有限公司，0.1 g/支），鹽酸賽拉秦注射液（華牧動(dòng)物保健品有限公司，40 mg/1支），熒光素鈉注射液（白云山明興制藥有限公司，0.6 g/支），復(fù)方托吡卡胺滴眼液（參天制藥有限公司，10 ml/支）。明睛顆粒由生蒲黃，旱蓮草等組成，其提取物由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥所提供，相當(dāng)于5.17 g生藥/g。

1.2 主要儀器

高速離心機(jī)（BY600A），酶標(biāo)儀（Rayto-RT6000），多波長氪激光機(jī)（lumenis novas variaXL），眼底造影機(jī)（Topcon 501X），Imagenet 2000圖像分析軟件。

1.3 造模與分組

1.3.1 動(dòng)物造模：用鹽酸氯胺酮（35 mg/kg）以及鹽酸賽拉秦（5 mg/kg）的混合液麻醉小鼠，復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳，眼前放置前置鏡，經(jīng)裂隙燈用659 nm激光機(jī)圍繞視盤在血管之間光凝10點(diǎn)，光斑直徑為50 μm，曝光時(shí)間為0.1 s，功率為180 mW，聚焦于Bruch’s膜，見到有氣泡產(chǎn)生時(shí)提示Bruch’s膜被擊破，為有效點(diǎn)，若出血或無氣泡出現(xiàn)視為無效點(diǎn)。

1.3.2 動(dòng)物分組及治療：將120只造模成功的小鼠隨機(jī)分為4組：灌胃治療組，灌水對照組，飲藥治療組，飲水對照組，每組30只。灌藥治療組：2 g/ml明睛顆粒溶液灌胃，每只小鼠灌胃0.3 ml，每日1次，相當(dāng)于0.6 g/（只·d）；灌水對照組：蒸餾水0.3 ml灌胃，每日1次。飲藥治療組：根據(jù)小鼠日平均飲水量3 ml，以明睛顆粒溶液取代飲用水讓小鼠自行飲用，濃度為0.2 g/ml，相當(dāng)于0.6 g/只/天；飲水對照組：正常飲用水喂養(yǎng)。30只未造模小鼠作為正常對照，正常喂養(yǎng)，不做任何治療。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 一般情況觀察：小鼠飲食、體重、皮毛、活動(dòng)、精神狀態(tài)等。

1.4.2 ELISA檢測外周血VEGF的含量：分別于給藥后第7天，第14天，第28天每組隨機(jī)抽取10只小鼠，摘眼球取血。血標(biāo)本離心30 min（3 000 r/min），取上清10 μl，按ELISA試劑盒說明書操作。

1.4.3 FFA觀察CNV面積：給藥后第28天每組抽取10只小鼠，按照前述方法麻醉及散瞳，腹腔內(nèi)注射20%熒光素鈉0.04 ml，行FFA檢查，觀察熒光素滲漏程度。采用Imagenet 2000圖像分析軟件測量各CNV的滲漏面積，取平均值比較。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組之間采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析，LSD法進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況觀察

治療過程中灌胃治療組及灌水對照組小鼠體重偏低，精神及活動(dòng)度稍差，2組因灌胃意外均死亡小鼠2只。飲藥及飲水組小鼠與正常組相比體重?zé)o明顯差異，精神及活動(dòng)度好，毛色正常。

2.2 小鼠外周血VEGF含量比較

給藥后第7天，灌胃治療組及飲藥治療組外周血VEGF含量均低于其相應(yīng)的對照組及正常組（P＜0.05）；灌胃治療組值低于飲藥治療組，但兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。給藥后第14天，各組VEGF值情況與給藥7天后相似，灌胃治療組外周血VEGF含量明顯低于灌胃對照組（P=0.003），也明顯低于正常組（P=0.002）；飲藥治療組外周血VEGF含量明顯低于飲水對照組（P=0.000）；灌胃治療組和飲藥治療組之間比較無明顯差異（P=0.179）。治療后28天，各治療組與對照組之間VEGF值相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但各組值均低于正常對照組（P＜0.05）（表1）。

表1 各處理組小鼠用藥后不同時(shí)間與空白對照組外周血VEGF含量的同期比較（±s，pg/ml）

表1 各處理組小鼠用藥后不同時(shí)間與空白對照組外周血VEGF含量的同期比較（±s，pg/ml）

注：與灌胃治療組比較，①P＜0.05，②P＞0.05；與飲藥治療組比較，③P＜0.05，④P＞0.05。第28天，各組與正?？瞻捉M比較，P＜0.05。VEGF：血管內(nèi)皮生長因子（單因素方差分析，兩兩比較用LSD法）

12.25614.591 0.0000.000第7天第14天第28天樣本量VEGF濃度樣本量VEGF濃度樣本量VEGF濃度正?？瞻捉M1095.89±22.85①③1095.89±22.85①③1095.89±22.85灌胃對照組10102.99±28.78①10106.32±23.27①1040.15±8.01②灌胃治療組1059.53±11.421062.14±18.341050.75±7.57飲水對照組10110.88±6.60③10101.33±31.59③1054.06±9.64④飲藥治療組1077.30±16.96②1066.40±19.23②1055.10±15.99 F值P值組別3.935 0.01

2.3 小鼠眼底CNV滲漏面積比較

正常小鼠FFA表現(xiàn)：視網(wǎng)膜血管以視盤為中心呈放射狀分布，脈絡(luò)膜血管呈網(wǎng)狀分布。模型小鼠FFA表現(xiàn)：光凝部位于動(dòng)脈早期出現(xiàn)強(qiáng)熒光，造影晚期表現(xiàn)為熒光擴(kuò)大增強(qiáng)。灌胃治療組造影晚期CNV滲漏面積明顯小于灌胃對照組（P=0.033），飲藥治療組也明顯小于飲水對照組（P=0.016），但2個(gè)藥物治療組之間無明顯差異（P=0.701）（表2）。

表2 各組眼底光凝小鼠治療后28天FFA檢查CNV滲漏面積比較（±s，μm2）

表2 各組眼底光凝小鼠治療后28天FFA檢查CNV滲漏面積比較（±s，μm2）

注：與灌胃治療組比較，①P=0.033；與飲藥治療組比較，②P= 0.016。灌胃治療組與飲水治療組比較，P=0.701。CNV：脈絡(luò)膜新生血管（單因素方差分析，兩兩比較用LSD法）

組別樣本量CNV滲漏面積灌胃對照組85.036±1.63①灌胃治療組82.86±0.88飲水對照組105.14±1.68②飲水治療組102.99±1.35 F值3.826 P值0.019

3 討論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藥理藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)常用的經(jīng)口給藥方法包括主動(dòng)口服給藥法和灌胃法。主動(dòng)口服法是將藥物混入飼料中或溶于飲水中任動(dòng)物自由攝取，灌胃法是指借助器械（灌胃針）將藥物直接灌入動(dòng)物胃內(nèi)。一般認(rèn)為灌胃給藥能準(zhǔn)確掌握給藥時(shí)間、給藥劑量，所以在藥理藥效實(shí)驗(yàn)中普遍采用。但是灌胃法除耗費(fèi)時(shí)間較多外，還對動(dòng)物造成一定程度的機(jī)械和心理的影響，技術(shù)不熟練容易造成動(dòng)物的死亡，尤其是小體積動(dòng)物以及需要長期用藥觀察的動(dòng)物，若使用灌胃給藥，會因?yàn)殚L期灌胃引起呼吸道損傷、胃膨脹，以及刺激肉芽組織發(fā)生。而且長期對小鼠暴力的抓取可能導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生應(yīng)激，引起動(dòng)物生理性的一些改變，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果〔1〕。與灌胃法相比，主動(dòng)口服給藥方法簡單，也不會因操作失誤而導(dǎo)致動(dòng)物死亡，因此，盡管此種方法存在給藥劑量難以準(zhǔn)確衡量等缺點(diǎn)，但隨著實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)的發(fā)展及一些需要長期給藥的實(shí)驗(yàn)要求，其在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用將會逐漸增多。

年齡相關(guān)性黃斑變性屬于慢性進(jìn)行性疾病，臨床治療周期長，1個(gè)療程多在3個(gè)月以上，給相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)帶來一定困擾，本實(shí)驗(yàn)從藥效學(xué)角度探討主動(dòng)口服給藥方法是否可以達(dá)到與灌胃給藥相似的效果。實(shí)驗(yàn)所使用的“明睛顆粒”是國醫(yī)大師唐由之總結(jié)的涼血化瘀方的顆粒劑，該方在臨床上應(yīng)用多年，對脈絡(luò)膜新生血管相關(guān)疾病如老年性黃斑變性、特發(fā)性脈絡(luò)膜新生血管（idiopathic choroidal neovascularization，ICNV）及病理性近視均顯示出較好的療效〔2-5〕；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方藥可以抑制VEGF的表達(dá)〔5〕。我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，灌胃組小鼠飲食量減少，活動(dòng)度及精神較差，并有因?yàn)楣辔笗r(shí)誤入氣管而出現(xiàn)意外死亡的情況。藥效方面，明睛顆粒治療后第7天、第14天，自動(dòng)口服給藥治療組和灌胃治療組小鼠的外周血VEGF含量均顯著低于2個(gè)對照組，灌胃組VEGF值降低更為明顯，但與口服給藥組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示2種給藥方法對小鼠外周血VEGF含量的影響相當(dāng)。從小鼠FFA檢查結(jié)果也可看出，2種給藥方法均可抑制CNV的形成及生長，療效無明顯差異。因此，從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，口服主動(dòng)給藥也是一種有效的給藥方法。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從藥效學(xué)角度對2種經(jīng)口給藥的方式予以評價(jià)，發(fā)現(xiàn)主動(dòng)口服給藥也能達(dá)到相似的治療結(jié)果。國外學(xué)者對主動(dòng)口服給藥方法予以改進(jìn)，將藥物與甜味劑混合后制成小藥丸或果凍形式訓(xùn)練動(dòng)物吞服，這樣既避免了灌胃帶來的副作用，又能保證定量給予〔6-8〕。所以，在一些動(dòng)物需要長期給藥觀察，年齡小不適宜灌胃，或者灌胃者技術(shù)不熟練的情況下，我們可以考慮使用把藥物加入食物或飲用水中讓動(dòng)物自行口服，從而減少對動(dòng)物機(jī)體的刺激和傷害，保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。在下一步的研究中，我們將從血藥濃度等藥學(xué)角度探討2種給藥方法的異同，為今后動(dòng)物實(shí)驗(yàn)給藥方法的選擇提供支持和幫助。

[1]De Meijer VE，Le HD，Meisel JA，Puder M.Repetitive orogastric gavage affects the phenotype of diet-induced obese mice[J].Physiol Behav 2010，100（4）：387-393.

[2]周尚昆，鐘舒陽，王慧娟.唐由之研究員治療濕性老年黃斑變性經(jīng)驗(yàn)[J].遼寧中醫(yī)雜志2011，38（1）：34.

[3]王慧娟，唐由之，巢國俊.涼血化瘀方治療濕性老年性黃斑變性患者90例臨床觀察[J].中醫(yī)雜志，2010，4（4）：316-318.

[4]王慧娟，唐由之.涼血化瘀方治療濕性老年性黃斑變性研究[J].中國中醫(yī)眼科雜志，2008，12（6）：322-324.

[5]唐由之，王慧娟，馮俊.涼血化瘀方對實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管VEGF和PEDF表達(dá)的影響[J].眼科新進(jìn)展，2009，12（29）：881-885.

[6]Atcha Z.Alternative method of oral dosing for rats[J].Am Assoc Lab Anim Sci，2010，49（3）：335-343.

[7]Goldkuhl R，Carlsson HE，Hau J，et al.Effect of subcutaneous injection and oral voluntary ingestion of buprenorphine on post-operative serum corticosterone levels in male rats[J].Eur Surg Res 2008，41（3）：272-278.

[8]Schleimer SB，Johnston GA，Henderson JM.Novel oral drug administration in an animal model of neuroleptic therapy[J].Neurosci Methods，2005，146（2）：159-164.

Comparing and evaluating the effect of two oral administration methods on experimental CNV mice

ZHAN Wenjie，TANG Youzhi，JIANG Wei，et al.Eye Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100040，China

OBJECTIVETo compare and evaluate the pharmacodynamic action of voluntary oral administration with intragastric gavage administration.METHODSC57BL/6 mice were induced CNV（choroidal neovascularization）by krypton laser and randomly divided into 4 groups:intragastric gavage control group，intragastric gavage treatment group，drinking water control group，drinking decoction treatment group.Ten normal mice were used as normal control without any treatment.The general state of health was observed.The VEGF（vascular endothelial growth factor）levels in peripheral blood were determined respectively by ELISA on day 7，14 and 28 after treatment，and the CNV leakage area was examined with FFA on day 28 of the treatment.RESULTSThe weights of mice in intragastric gavage groups were lower than that of the voluntary oral administration groups.And the spirit condition，the activity as well as the color pattern of the mice in intragastric gavage groups were also worse than that of the voluntary oral administration groups.The VEGF level in peripheral blood of the two treatment groups were significantly lower than that of its corresponding control groups and normal group on day 7 and day 14 after treatment（P＜0.05）.There were no significant differences between intragastric gavage groups and voluntary oral administration groups（P=0.179）.The CNV leakage area of FFA in the two treatment groups were significantly smaller than that of its corresponding control groups on day 28 after treatment（P＜0.05）.There was no significant difference between the intragastric gavage group and the voluntary oral administration group（P=0.701）.CONCLUSIONSVoluntary oral administration could have the same pharmacodynamic action as the method of intragastric gavage.For the long-term treating animal experiment or the experiment using tiny animals,voluntary oral administration method is an effective alternative.

intragastric gavage；voluntary oral administration；mice；CNV（choroidalneovascularization）

R-331

A

1002-4379（2012）04-0235-04

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81072846）

1中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院，北京100040

2廣州中醫(yī)藥大學(xué)

3中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院

梁麗娜，E-mail：lianglina2001@hotmail.com