龍向淑， 吳 強(qiáng)， 宋 方

(貴州省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴州貴陽550002)

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是維持血管張力和功能的主要細(xì)胞成分，在動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓以及冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)后再狹窄等血管增殖性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著非常重要的角色。干擾素誘導(dǎo)蛋白p204(interferon－inducible protein 204，p204)是干擾素(interferon，IFN)誘導(dǎo)蛋白p200家族的鼠類蛋白成員，其編碼基因Ifi204由耶魯大學(xué)Lengyel教授等首先發(fā)現(xiàn)并成功克?。?］，在鼠的心肌、骨骼肌、腎及成骨細(xì)胞等多種組織、細(xì)胞存在豐富表達(dá)［2］。有研究［3－5］顯示，p204可通過多種機(jī)制抑制多種細(xì)胞型的增殖，但p204在VSMCs是否存在基礎(chǔ)表達(dá)及其對(duì)大鼠VSMCs增殖等生物學(xué)行為的影響尚未見報(bào)道。本研究旨在通過誘導(dǎo)p204在VSMCs的過表達(dá)和沉默，觀察VSMCs的增殖變化，探討p204對(duì)VSMCs增殖的影響及其可能機(jī)制，為血管增殖性疾病的防治提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 大鼠VSMCs的培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

IFN－α購自北京三元基因工程有限公司;DMEM高糖型細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自HyClone;α－SMA單克隆抗體(BM0002)、即用型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒為武漢博士德公司產(chǎn)品;Control siRNA－A(sc－36869)購自 Santa Cruz;Ifi204 siRNA由寶生物工程(大連)有限公司合成，序列見表1;LipofectamineTM2000 Reagent購自Invitrogen。純種SD大鼠(雌雄不拘)3只(購自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重120～140 g，按文獻(xiàn)［6］介紹的方法進(jìn)行胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)、純化及鑒定。取4～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為5組，即陰性對(duì)照組(N組)、非特異性siRNA對(duì)照組(C組)、IFN－α誘導(dǎo)組(IFN組)、20%FBS+IFN－α組(F+I組)和Ifi204 siRNA轉(zhuǎn)染組(siRNA組)。各組干預(yù)6 h，繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞。

表1 siRNA及引物序列Table 1.The sequences of primers and siRNA

2 RT－PCR法檢測(cè)mRNA表達(dá)

TRNzol總RNA提取試劑(DP405)、2×Taq PCR Master Mix(KT201)、100 bp DNA ladder購自北京天根公司;RT－PCR兩步法試劑盒購自 TaKaRa(DRR047A);PCR擴(kuò)增引物由寶生物工程(大連)有限公司合成(表1)。按TRNzol總RNA提取試劑盒說明操作提取總RNA，取1 μg按RT－PCR試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取產(chǎn)物3 μL進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性3 min，94℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72℃ 1 min，擴(kuò)增 30 個(gè)循環(huán)，最后 72℃5 min。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物5 μL在2%瓊脂糖凝膠中電泳分析，UVP800型凝膠成像系統(tǒng)成像。

3 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

p204抗體(sc－13367)購自 Santa Cruz;p21抗體(ab92675)購自Abcam;Tubulin抗體(AT819)購自碧云天;Western blotting marker(CW0021)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。按藥立波主編的《醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》介紹的方法進(jìn)行蛋白樣品的制備、定量、分離、轉(zhuǎn)膜、印跡，從而測(cè)定特定蛋白的相對(duì)含量。

4 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力

四甲基偶氮唑鹽［3－(4，5－dimethylthiazol－2－yl)－2，5－diphenyltetrazolium bromide，MTT］購自 Sigma。收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按細(xì)胞數(shù)3 000個(gè)/孔接種于96孔板，各組干預(yù)方法同上述實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)板用平板離心機(jī)4 000 r/min離心5 min，充分吸盡上清。每孔加入150 μL DMSO，置旋轉(zhuǎn)搖床上低速振蕩10 min，酶聯(lián)免疫儀490 nm波長檢測(cè)各孔吸光度(A)值。

5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(C1052)購自碧云天。按細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(C1052)說明書操作收集細(xì)胞、染色后采用配套軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 p204在VSMCs的基礎(chǔ)表達(dá)和干預(yù)因素的影響

1.1 p204在 VSMCs的基礎(chǔ)表達(dá) RT－PCR和Western blotting顯示，p204在VSMCs有一定豐度的基礎(chǔ)表達(dá)，見圖1、2。

Figure 1.Effect of intervention factors on the expression of p204 mRNA in VSMCs.IFN:IFN－α induction group;F+I:20%FBS+IFN－α group;N:negative group;C:control siRNA group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.圖1 干預(yù)因素對(duì)VSMCs p204 mRNA表達(dá)的影響

Figure 2.Effect of intervention factors on the expression of p204 protein in VSMCs.IFN:IFN－α induction group;F+I:20%FBS+IFN－α group;N:negative group;C:control siRNA group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.圖2 干預(yù)因素對(duì)VSMCs p204蛋白表達(dá)的影響

1.2 干預(yù)因素對(duì)p204表達(dá)的影響 與N組比較，IFN和F+I組p204 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，siRNA組p204mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，而C組與N組的差異無顯著，見圖1、2和表2。

2 p204表達(dá)對(duì)VSMCs增殖的影響

2.1 p204表達(dá)對(duì)VSMCs活力的影響 與N組比較，IFN組、F+I組的MTT吸光度降低(P＜0.05)，siRNA組增高(P＜0.05)，而C組與N組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

2.2 p204表達(dá)對(duì)VSMCs細(xì)胞周期的影響 與N組比較，IFN和F+I組的G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少(P＜0.05);siRNA組 G0/G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增多(P＜0.05);C組與N組的G0/G1期和S期細(xì)胞比較，差異無顯著，見圖3、表2。

3 p21表達(dá)的變化

3.1 p21mRNA水平的變化 RT－PCR結(jié)果顯示，IFN組、F+I組的p21 mRNA表達(dá)較N組升高(P＜0.05)，siRNA組較N組減少(P ＜0.05)，C組與N組間差異不顯著，見圖4、表2。

表2 誘導(dǎo)p204過表達(dá)和沉默對(duì)VSMCs增殖和p21表達(dá)的影響Table 2.Effect of excessive expression and silencing of p204 on expression of p21 and proliferation of VSMCs(±s.n=3)

表2 誘導(dǎo)p204過表達(dá)和沉默對(duì)VSMCs增殖和p21表達(dá)的影響Table 2.Effect of excessive expression and silencing of p204 on expression of p21 and proliferation of VSMCs(±s.n=3)

IFN:IFN－α induction group;F+I:20%FBS+IFN－α group;N:negative group;C:control siRNA group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.*P ＜0.05 vs negative group.

p21mRNA p21protein N 0.99 ±0.03 0.34 ±0.07 0.67 ±0.06 83.79 ±1.96 1 Group p204 mRNA p204 protein MTT(A value)G0/G1stage(%) S stage(%)0.39 ±1.17 0.45 ±0.06 0.18 ±0.04 C 1.03 ±0.04 0.37 ±0.09 0.66 ±0.03 84.12 ±2.59 10.15 ±1.62 0.46 ±0.08 0.16 ±0.03 IFN 1.88 ±0.07* 0.81 ±0.09* 0.47 ±0.05* 91.33 ±2.09* 7.07 ±1.44* 0.72 ±0.04* 0.38 ±0.03*F+I 1.68 ±0.06* 0.75 ±0.08* 0.53 ±0.06* 89.53 ±2.82* 7.37 ±1.04* 0.70 ±0.07* 0.35 ±0.06*siRNA 0.21 ±0.05* 0.13 ±0.04* 0.88 ±0.04* 78.75 ±1.62* 16.52 ±2.07* 0.21 ±0.03* 0.08 ±0.02*

Figure 3.Effect of p204 expression on cell cycle of VSMCs.IFN:IFN－α induction group;F+I:20%FBS+IFN－α group;N:negative group;C:control siRNA group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.±s.n=3.△P ＜0.05 vs negative group.圖3 p204表達(dá)變化對(duì)VSMCs細(xì)胞周期的影響

Figure 4.Effects of p204 expression on p21 mRNA and protein in VSMCs.IFN:IFN－α induction group;F+I:20%FBS+IFN－α group;N:negative group;C:control siRNA group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.圖4 p204表達(dá)變化對(duì)VSMCs p21 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

3.2 P21蛋白水平的變化 Western blotting結(jié)果顯示，IFN組、F+I組的p21蛋白表達(dá)較N組增多(P＜0.05)，siRNA組較N組減少(P＜0.05)，見圖4、表2。

討 論

血管重塑是血管增殖性疾病的主要病理生理機(jī)制，在血管重塑的發(fā)生、發(fā)展過程中，VSMCs增殖、遷移以及血管基質(zhì)的改變起著重要作用。

VSMCs的增殖是多階段、多因子參與的精確、有序的調(diào)節(jié)過程。IFN是一組具有抗病毒、抗增殖、影響細(xì)胞生長和分化、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等眾多生物學(xué)功能的活性細(xì)胞因子家族［7］。IFN與相應(yīng)受體結(jié)合后，通過啟動(dòng)包括Janus激酶(Janus kinase，JAK)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducer and activator of transcription，STAT)在內(nèi)的一系列級(jí)聯(lián)信號(hào)放大系統(tǒng)，誘導(dǎo)一系列IFN誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮其抗病毒、影響細(xì)胞增殖等生物學(xué)效應(yīng)［8］。IFN的抗病毒及免疫調(diào)節(jié)功效已經(jīng)明確，而其調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的功能，如抗增殖、促凋亡或存活、促進(jìn)衰老和分化及抑制血管生成的作用及機(jī)制尚存在爭議［7］。

有研究［9］顯示，IFN－γ可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin dependent kinase 2，CDK2)/細(xì)胞周期蛋白E(cyclin E)的活性及抑制E2啟動(dòng)子結(jié)合因子1(E2 promoter－binding factor 1，E2F－1)基因的表達(dá)而阻礙氣道平滑肌細(xì)胞的G1/S轉(zhuǎn)換，從而抑制該細(xì)胞的增殖。亦有文獻(xiàn)［10］報(bào)道，p204通過不同機(jī)制影響骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的增殖或分化。但p204在VSMCs是否存在基礎(chǔ)表達(dá)，對(duì)VSMCs增殖有無影響尚無研究報(bào)告。本研究結(jié)果顯示，大鼠VSMCs存在基礎(chǔ)水平的p204表達(dá)，且可被IFN－α誘導(dǎo)過表達(dá)，提示VSMCs可能也是p204調(diào)控增殖的靶細(xì)胞型。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IFN－α干預(yù)可明顯抑制VSMCs增殖，阻滯或延緩VSMCs細(xì)胞周期由G0/G1期進(jìn)入S期;相反，轉(zhuǎn)染針對(duì)p204 mRNA重要功能區(qū)域保守序列設(shè)計(jì)的特異性siRNA可明顯下調(diào)p204 mRNA和蛋白水平，并促進(jìn)VSMCs增殖，上調(diào)S期細(xì)胞比例，表明p204具有抑制大鼠VSMCs增殖的作用。同時(shí)，IFN－α可抑制FBS的促VSMCs增殖作用，并上調(diào)p204 mRNA和蛋白表達(dá)，也進(jìn)一步證實(shí)IFN－α可通過上調(diào)p204表達(dá)抑制VSMCs增殖。

p21是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子的CIP/KIP家族成員，是哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子，其啟動(dòng)子上有p53的結(jié)合位點(diǎn)，是p53調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的靶基因。有研究［11］顯示，p21具有抗增殖作用，參與細(xì)胞終末分化和衰老的調(diào)控。P21的表達(dá)除受p53轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)外，也存在非p53依賴信號(hào)通路，如p200家族成員p202、STAT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等［12－13］。本研究結(jié)果顯示，無論是誘導(dǎo)p204過表達(dá)還是沉默表達(dá)，p21的mRNA和蛋白水平均與p204呈一致性變化趨勢(shì)。由于p204可通過其200個(gè)氨基酸的MF/LHATVAT/S模序介導(dǎo)與53BP1的結(jié)合而活化p53，結(jié)合本研究結(jié)果認(rèn)為，p204抑制VSMCs和細(xì)胞周期進(jìn)展的作用可能與促進(jìn)p21表達(dá)有關(guān)。至于p204是否可通過非p53依賴通路直接與p21相互作用還有待進(jìn)一步研究。

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