王建衛(wèi)， 李 杭， 潘志軍

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院骨科，浙江杭州310009)

近期的許多研究表明他汀類藥物具有促成骨作用［1－3］。我們的前期研究也證實(shí)了降脂藥－辛伐他汀(simvastatin，SVS)局部注射能促進(jìn)去勢(shì)大鼠骨折愈合的質(zhì)量［4］，但他汀類藥物對(duì)骨代謝的確切機(jī)制目前尚缺乏深入的研究。

骨保護(hù)蛋白(osteoprotegerin，OPG)作為一種最近發(fā)現(xiàn)的可溶性腫瘤壞死因子受體超家族成員，被認(rèn)為對(duì)骨代謝起著重要作用。OPG是一種由成骨/基質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等分泌的蛋白多糖，其通過與破骨細(xì)胞分化因子(osteoprotegerin ligand/receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，OPGL/RANKL)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，阻止OPGL/RANKL與破骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞膜上的受體RANK(receptor activator of nuclear factor kappa B)相結(jié)合，從而阻斷OPGL/RANKL對(duì)破骨細(xì)胞各階段產(chǎn)生的作用，達(dá)到抑制骨吸收的作用［5］。已有研究表明白細(xì)胞介素(interleukin，IL)、腫瘤壞死因子 β(tumor necrosis factor β，TNF－β)、1，25 二羥基維生素 D3［1，25(OH)－D3］、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2(bone morphogenetic protein 2，BMP－2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(transforming growth factor β，TGF－β)、雌激素等均能刺激成骨細(xì)胞OPG mRNA及其蛋白的表達(dá)［6－7］。雖然已有少量研究表明他汀類藥物也可影響體外培養(yǎng)人成骨細(xì)胞或人體血液中的OPG表達(dá)水平［8－10］，但目前尚缺乏體內(nèi)組織學(xué)水平的研究結(jié)果。我們?cè)谇捌谘芯康幕A(chǔ)上，對(duì)骨折標(biāo)本進(jìn)一步研究，以了解去勢(shì)及辛伐他汀對(duì)新生骨痂OPG表達(dá)情況的影響，為他汀類成骨作用的機(jī)制研究提供更多的證據(jù)。

材料和方法

1 動(dòng)物

2月齡雌性SD大鼠(清潔級(jí)，購(gòu)自浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，初始體重178～201 g，飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，23℃恒溫，晝夜12 h。大鼠飼料含鈣0.46%，含磷0.38%，自由進(jìn)食自來水。

2 去勢(shì)

大鼠隨機(jī)分成OVX組(n=60)和假手術(shù)(sham)組(n=30)。按以往方法對(duì)大鼠行去勢(shì)術(shù)［11］。術(shù)后喂養(yǎng)于原環(huán)境。為了減少OVX后大鼠體重的增加，對(duì)OVX組大鼠實(shí)行飲食控制(即給予和sham組大鼠等量的食物)。

術(shù)后12周，各取10只大鼠，全麻后測(cè)量右側(cè)脛骨骨礦物含量(bone mineral density，BMD)。本實(shí)驗(yàn)使用雙能X線吸收儀(dual－energy X－ray absorptiometer，DEXA，LUNAR Radiation)，應(yīng)用其配套的小動(dòng)物模式進(jìn)行BMD的測(cè)量，測(cè)量電壓為76 kV，電流為150 μA。該儀器的準(zhǔn)確率為0.3%，組間變異系數(shù)(CV)為1.3%。

3 骨折內(nèi)固定模型

所有大鼠分成sham+vehicle組(n=30)、OVX+vehicle組(n=30)和OVX+SVS組(n=30)，進(jìn)一步用以建立骨折內(nèi)固定模型。全麻后，在右脛骨近1/3處用骨刀平整切斷脛骨，盡量不折斷同側(cè)腓骨，為穩(wěn)定骨折端，用直徑0.5 mm的消毒牙科鋼絲(上海醫(yī)用縫針廠)經(jīng)脛骨結(jié)節(jié)插入，對(duì)骨折端行髓內(nèi)固定，縫合切口，術(shù)后抗炎3 d(青霉素8×105U，im，每天2次)。

4 給藥

骨折端皮下注射SVS或空白溶劑(vehicle)，骨折手術(shù)當(dāng)天注射1次，骨折后連續(xù)5 d，每天2次。按文獻(xiàn)方法配制5%SVS溶液［1］，即SVS溶解于含2%二甲亞砜和0.1%小牛血清白蛋白的PBS溶液中。每次注射5 mg·kg－1的SVS或相應(yīng)體積(約30～50 μL)的vehicle溶劑。本實(shí)驗(yàn)的注射方法參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行［1］。為了避免局部反復(fù)注射對(duì)骨折愈合的干擾，本實(shí)驗(yàn)中的局部注射是指鄰近骨折端的皮下注射，而不是向骨痂內(nèi)的直接注射。注射針頭直徑為0.4 mm，注射器最大刻度為250 μL，最小刻度為10 μL(上海醫(yī)用激光儀器有限公司)。注射過程中避免對(duì)骨痂的干擾。

5 組織學(xué)分析

骨折后1、2、4周每組各取5只用作組織學(xué)分析。處死大鼠后連同骨痂周圍骨膜取下右側(cè)脛骨。抽出髓內(nèi)釘，切取包含骨痂的骨段，4%多聚甲醛(pH 7.4)室溫下固定24 h，EDTA 液(0.5 mol/L，pH 7.4)脫鈣3～5周，每5～7 d更換新鮮脫鈣液至能被細(xì)針輕松插入。PBS液沖洗，乙醇梯度脫水，石蠟包埋。縱向5μm切片，固定于經(jīng)0.01% 多聚賴氨酸表面處理的載玻片上，60℃烘干過夜。

脫鈣組織切片予增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)(武漢博士德生物工程有限公司)和OPG抗體(sc－8468)(Santa Cruz Biotechnology)免疫組化染色，每周取5個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本1張切片，每張切片4個(gè)高倍(×400)視野。計(jì)算每個(gè)視野下所有細(xì)胞中PCNA陽性細(xì)胞占有率(分成36個(gè)單元格計(jì)數(shù))，計(jì)算4個(gè)視野的平均值比較。對(duì)OPG免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量分析。每張切片按染色強(qiáng)度記分為:弱:1;中:2;強(qiáng):3。按染色范圍記分為:1:＜25%;2:25%～50%;3:＞50%。上述評(píng)分相加所得值分級(jí)為:+:2.0 ～3.0;++:3.0 ～4.5;+++:4.5 ～6.0。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本實(shí)驗(yàn)為成組設(shè)計(jì)。用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。BMD及PCNA陽性率數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，行方差分析。對(duì)于OPG染色情況行多組完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的Mann－Whitney秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

OVX后12周，sham組和OVX組脛骨BMD有顯著差異［分別為(0.241 ±0.010)g/cm2和(0.219 ±0.005)g/cm2，P＜0.01］。

骨折后OVX+vehicle組和OVX+SVS組分別有4只和3只大鼠死亡。無1例發(fā)生骨折端感染。3組大鼠間體重沒有顯著差異。

PCNA免疫組化陽性細(xì)胞呈棕黃色，定位在細(xì)胞核中，陰性細(xì)胞呈藍(lán)色。結(jié)果顯示OVX+vehicle組骨折后1、2、4周PCNA陽性率較sham+vehicle組分別下降17.3%、32.1%和26.1%(P＜0.01);OVX+SVS組骨折后1、2、4周 PCNA 陽性率較 OVX+vehicle組分別增加60.1%、67.7%和67.7%(P ＜0.01)，見圖1、表1。該結(jié)果提示去勢(shì)可影響骨折愈合過程中骨痂的細(xì)胞增殖，而SVS可促進(jìn)骨痂細(xì)胞增殖，與我們前期的生物力學(xué)及形態(tài)學(xué)研究結(jié)果相一致［3］。

Figure 1.PCNA immunohistochemical staining of bone callus(×400).圖1 骨折后各周骨痂PCNA免疫組化染色

表1 骨痂PCNA免疫組化染色陽性率比較Table 1.Comparison of PCNA positive staining(%.±s.n=5)

表1 骨痂PCNA免疫組化染色陽性率比較Table 1.Comparison of PCNA positive staining(%.±s.n=5)

△△P＜0.01 vs sham+vehicle group;##P＜0.01 vs OVX+vehicle group.

Group 1 week 2 weeks 4 weeks Sham+vehicle 48.51 ±4.12 53.45 ±5.68 22.80 ±2.16 OVX+vehicle 40.10 ±1.64△△ 41.10 ±1.43△△ 16.84 ±2.14△△OVX+SVS 64.21 ±4.89## 68.93 ±0.64## 28.24 ±1.67##

OPG陽性染色呈棕黃色，主要表達(dá)在成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中，在骨基質(zhì)中也有彌漫性黃染。半定量結(jié)果顯示OVX+vehicle組OPG表達(dá)水平最低，sham+vehicle組最高，而OVX+SVS組的OPG表達(dá)水平介于2組之間，見圖2、表2。OVX+SVS組與OVX+vehicle組間在骨折后各周均有極顯著差異(P＜0.01)，OVX+vehicle組與sham+vehicle組間在骨折后1、2周也有顯著差異(P＜0.05)。該結(jié)果表明去勢(shì)可明顯減少新生骨OPG的表達(dá)，而SVS可部分阻止因去勢(shì)引起的OPG分泌減少。

討 論

本研究從動(dòng)物體內(nèi)組織學(xué)水平研究了去勢(shì)及辛伐他汀局部應(yīng)用對(duì)大鼠骨痂OPG表達(dá)的影響。

辛伐他汀口服后，絕大部分沉積在肝臟，僅5%分布在血液中［12］，在骨骼中的濃度則更低，如此低的濃度極易受到很多因素的干擾從而造成臨床結(jié)果的變異。同時(shí)，在正常骨骼中，由于骨重建單位相對(duì)較少，他汀類藥物的骨骼作用受到一定的限制，而在骨折愈合過程中，骨重建單位大大增加，因此，骨骼對(duì)藥物反應(yīng)的表現(xiàn)將被放大。在本實(shí)驗(yàn)中，辛伐他汀通過局部微量注射器被注射于骨折端皮下。這樣可通過局部簡(jiǎn)單擴(kuò)散作用增加骨折端的藥物濃度，該濃度將遠(yuǎn)比通過整體給藥所能達(dá)到的骨折端濃度高。

PCNA是一個(gè)分子量為37 kD的蛋白，特異地表達(dá)于細(xì)胞增殖周期的S期。在腫瘤病理學(xué)檢查中常用于判斷腫瘤的良惡性。在骨折愈合過程中，PCNA的表達(dá)強(qiáng)度可以反映骨痂中的細(xì)胞增殖情況。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)去勢(shì)組骨痂PCNA表達(dá)較空白對(duì)照組低，而實(shí)驗(yàn)組較去勢(shì)組高，差異均有顯著性。該結(jié)果從另一角度證明了去勢(shì)可影響大鼠骨折愈合的質(zhì)量，而辛伐他汀局部注射可促進(jìn)去勢(shì)大鼠的骨折愈合。

骨量的維持依賴于骨形成過程與骨吸收過程之間的動(dòng)態(tài)平衡，任何影響骨代謝的因素均通過調(diào)節(jié)這一動(dòng)態(tài)平衡而發(fā)揮作用?？构琴|(zhì)疏松藥根據(jù)其作用機(jī)制可分為促成骨類藥物和抗骨吸收藥物，目前治療骨質(zhì)疏松的大多數(shù)藥物，如雌激素、雙膦酸鹽類化合物、降鈣素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑等，主要通過抑制骨吸收防止骨量丟失，而刺激新骨形成的藥物為數(shù)很少。他汀類藥物自最初被Mundy等［1］發(fā)現(xiàn)具有促成骨作用以來，隨后的很多研究均表明他汀類藥物可直接刺激成骨細(xì)胞BMP－2的表達(dá)［13－14］，從而直接促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨作用。因而他汀類藥物被認(rèn)為是一種具有直接促成骨作用的潛在抗骨質(zhì)疏松藥物。

Figure 2.OPG immunohistochemical staining of bone callus(×400).圖2 骨折后各周骨痂OPG免疫組化染色

表2 骨痂OPG免疫組化陽性染色半定量分析Table 2.Semiquantitative analysis of OPG

OPG是成骨細(xì)胞分泌的一種新的TNF受體超家族成員，是成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化及其活性的重要物質(zhì)。OPG對(duì)可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANKL，從而抑制RANKL與破骨細(xì)胞及其細(xì)胞上RANK相結(jié)合，最終起到抑制破骨細(xì)胞增殖和分化。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，去勢(shì)可使大鼠骨痂OPG表達(dá)減少，該結(jié)果從反面提示了雌激素通過OPG發(fā)揮抑制破骨細(xì)胞的作用機(jī)制，與以往的實(shí)驗(yàn)相一致［6］。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可使去勢(shì)大鼠骨痂OPG表達(dá)增加，提示他汀類藥物不僅能刺激成骨細(xì)胞表達(dá)BMP－2，直接促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，同時(shí)還通過刺激成骨細(xì)胞表達(dá)OPG間接抑制破骨細(xì)胞的增殖分化。

當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)尚存在一些不足之處。首先，我們未能對(duì)破骨細(xì)胞的數(shù)量和功能作直接或間接的檢測(cè);其次，我們也未能對(duì)成骨細(xì)胞表達(dá)的其它因子，如BMP－2、RANKL等予以檢測(cè)。盡管如此，結(jié)合目前已有的對(duì)于OPG骨調(diào)節(jié)作用的認(rèn)識(shí)，本研究提示他汀類藥物還具有間接抑制破骨細(xì)胞的作用。

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