龜鹿二仙膠及其拆方對(duì)豚鼠軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原合成的影響※

● 黃遠(yuǎn)鵬 李 楠 杜 江 李奕修 王和鳴

骨性關(guān)節(jié)炎(ostcoarthritis，OA)，又稱(chēng)骨關(guān)節(jié)病，肥大性關(guān)節(jié)病，增生性關(guān)節(jié)病，是一種以軟骨外基質(zhì)缺失及異常重建的退行性疾病［1－2］。其結(jié)構(gòu)性變化特征包括:逐漸喪失關(guān)節(jié)軟骨，在關(guān)節(jié)邊緣骨贅的形成和軟骨下骨囊腫的發(fā)展［3－5］。OA在中醫(yī)理論中屬于“痹證”中“骨痹”范疇，以肝腎虧虛為其根本，故治療上，補(bǔ)肝腎之虛，扶正固本為其治療原則。臨床研究中發(fā)現(xiàn)，龜鹿二仙膠能夠有效的減輕OA患者的癥狀，改善其關(guān)節(jié)功能［6］。前期研究發(fā)現(xiàn)，龜鹿二仙膠能夠有效的促進(jìn)SD大鼠及豚鼠軟骨細(xì)胞的增殖，抑制SD大鼠軟骨細(xì)胞的凋亡，能夠促進(jìn)豚鼠軟骨細(xì)胞蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成［7－9］，驗(yàn)證了龜鹿二仙膠的補(bǔ)虛作用對(duì)OA的影響。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)人參枸杞在方中配伍的意義而設(shè)計(jì)，具體報(bào)道如下。

1 材料

1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(低糖)、PBS緩沖液、胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclone)、Ⅱ型膠原酶(Sigma)、兔超敏二步發(fā)免疫組化檢測(cè)試劑盒、濃縮型DAB染色試劑盒(中衫金橋)、Rabbit Anti－Collagen Type II(Abcam)。

1.2 主要儀器設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱(Heal Firce公司212 UV型)、超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰)、倒置顯微鏡(OLYMPUS IX70型)、萬(wàn)能研究級(jí)顯微鏡(OLYMPUS)、顯微圖像處理系統(tǒng)(Motic Imges Advance 3.2)、數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(Motic Med 6.0)(麥克奧迪)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康1月齡清潔級(jí)雄性Wistar大鼠50只，體重190～210g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2007－0005;合格證號(hào):0069141。3月齡清潔級(jí)豚鼠4只(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2007－0005)，以上動(dòng)物均由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥物 龜鹿二仙膠由龜甲膠(1∶1)、鹿角膠(1∶1)、人參(1∶5)、枸杞(1∶3)四味中藥組成，均為農(nóng)本方中藥配方顆粒，生產(chǎn)批號(hào):龜甲膠A101209－01，鹿角膠 A100010－01，人參 A101134－02，枸杞A100873－02。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組 雄性Wistar大鼠50只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，隨機(jī)分為5組，每組10只:分別為生理鹽水(對(duì)照)組、龜鹿二仙膠(全方)組、龜板鹿角(龜鹿)組、龜板鹿角人參(龜鹿參)組、龜板鹿角枸杞(龜鹿杞)組，苦味酸標(biāo)記。

2.2 藥物制備 參照《中醫(yī)骨傷科學(xué)基礎(chǔ)》教材，按照龜板9g、鹿角6g、人參6g、枸杞9g的配伍比例定為人的用藥劑量，大鼠給藥劑量根據(jù)人與大鼠按體表面積換算的藥物等效劑量換算公式［10］計(jì)算，得出以下給藥劑量:

表1 各味中藥換算后的劑量［g/只(200g)］

2.3 動(dòng)物給藥及含藥血清的制備 對(duì)照組予相應(yīng)劑量的0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)給藥7天，每日清晨一次，每次3ml，最后一次灌藥(灌藥前禁食不禁水12小時(shí))一小時(shí)后腹主動(dòng)脈采血，3000r/min離心15分鐘，取上清，56℃水浴滅活30分鐘，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾分裝、標(biāo)記，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 軟骨細(xì)胞分離及培養(yǎng) 3月齡豚鼠處死，消毒，取出膝關(guān)節(jié)，在超凈臺(tái)上分離關(guān)節(jié)軟骨面，切取軟骨，將關(guān)節(jié)軟骨剪成約1mm3大小，PBS漂洗，37℃ 5mL 0.2%Ⅱ型膠原酶消化45min，取上清，離心收集細(xì)胞，重復(fù)4次，將細(xì)胞懸液稀釋為2×105個(gè)/mL，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，加含10%FBS的 DMEM培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.5 免疫組化染色檢測(cè)各組含藥血清對(duì)豚鼠軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原合成的影響 將F1代的細(xì)胞以1×104/ml的密度傳代至鋪有4%多聚賴(lài)氨酸蓋玻片的24孔板中，24小時(shí)軟骨細(xì)胞貼壁后，加入各組含10%含藥血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)，每組4孔，制作細(xì)胞爬片，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，檢測(cè)各組Ⅱ型膠原含量。

2.6 圖像分析 免疫組化染色標(biāo)本均在萬(wàn)能研究級(jí)顯微鏡下觀察，Motic Images Advance 3.2顯微圖像處理軟件采集圖片，每組標(biāo)本隨機(jī)選取6個(gè)視野，拍照保存，圖片數(shù)據(jù)采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行分析，測(cè)定標(biāo)本中陽(yáng)性信號(hào)平均灰度值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析，成組數(shù)據(jù)比較采用 t檢驗(yàn)，以 P ＜0.05表示有顯著差異，P＞0.05表示無(wú)顯著差異。

3 結(jié)果

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組含藥血清對(duì)軟骨細(xì)胞分泌Ⅱ型膠原的影響，見(jiàn)圖1～6、表2。可見(jiàn)，五組均有陽(yáng)性異染，Ⅱ型膠原陽(yáng)性異染部位為胞漿，呈片狀或團(tuán)塊狀的棕紅色顆粒染色。圖中，胞核呈藍(lán)紫色染色，是經(jīng)蘇木素復(fù)染的結(jié)果。其中，全方組異染顏色最深，對(duì)照組異染顏色最淺。表2顯示，與對(duì)照組比較，四組含藥血清均能明顯的促進(jìn)豚鼠軟骨細(xì)胞合成Ⅱ型膠原(P＜0.05)。全方組藥效高于其他四組(P＜0.05)，龜鹿參組與龜鹿杞組促Ⅱ型膠原合成能力明顯優(yōu)于龜鹿組(P＜0.05)，龜鹿杞組比龜鹿參組效果更佳。(P ＜0.05)。

表2 免疫組化染色檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原合成的情況(n=6，±s)

表2 免疫組化染色檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原合成的情況(n=6，±s)

注:與對(duì)照組比較:△P ＜0.05;與龜鹿組比較:▲P ＜0.05;與全方組比較:*P＜0.05;龜鹿參組與龜鹿枸組對(duì)比:P＜0.05。

組平均灰度值別全方組 141.40 ±1.378△▲龜鹿組 128.49 ±3.384△＊龜鹿參組 133.63 ±2.605△▲＊龜鹿杞組 135.23 ±5.498△▲＊對(duì)照組 116.27 ±5.805▲＊

4 討論

骨性關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨損傷和骨質(zhì)增生為特點(diǎn)的非炎癥性疾病。其病理改變是關(guān)節(jié)軟骨的病變。關(guān)節(jié)軟骨由99%的軟骨外基質(zhì)和1%的軟骨細(xì)胞組成，膠原蛋白是軟骨基質(zhì)中最主要的成分之一，約占成人關(guān)節(jié)軟骨干重的2/3［11］。其中Ⅱ型膠原占90%以上，是軟骨保持結(jié)構(gòu)的緊密性和生物力學(xué)特性的基礎(chǔ)。其合成及分解的動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系到軟骨外基質(zhì)的合成和降解平衡。因此Ⅱ型膠原的表達(dá)正常與否是衡量軟骨細(xì)胞反分化和表型異常的重要依據(jù)。豚鼠軟骨的降解與人類(lèi)OA的發(fā)展非常相似［12］，3月后豚鼠關(guān)節(jié)面粗糙，中央呈現(xiàn)小顆粒并有輕度凹陷，軟骨面無(wú)光澤，干燥呈微黃色［13］。因此，本實(shí)驗(yàn)取3月齡豚鼠軟骨細(xì)胞作為研究對(duì)象。

注:圖1－6為各組含藥血清對(duì)豚鼠軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原合成的影響(×200)

中醫(yī)認(rèn)為OA是受風(fēng)、寒、濕三邪所致，加以肝血腎精虧虛，氣血不足，筋骨失養(yǎng)，形體疲極而易發(fā)本病。龜鹿二仙膠具有溫腎益精，補(bǔ)氣養(yǎng)血作用。主治腎中陰陽(yáng)兩虛，任、督精血不足。其中鹿角膠補(bǔ)腎助陽(yáng)、強(qiáng)筋壯骨，龜甲膠滋陰潛陽(yáng)、養(yǎng)血補(bǔ)心，兩者一溫一寒，一陰一陽(yáng)，合用能峻補(bǔ)陰陽(yáng)以生氣血精髓。人參大補(bǔ)元?dú)?，枸杞補(bǔ)腎益精。四藥合用，為陰陽(yáng)氣血交補(bǔ)之劑，共具填補(bǔ)精髓、益氣壯陽(yáng)之功。

實(shí)驗(yàn)中，各藥物組標(biāo)本均呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，軟骨細(xì)胞胞漿中呈現(xiàn)棕黃色顆?；虺蕡F(tuán)塊狀。全方組、龜鹿組、龜鹿參組、龜鹿杞組對(duì)Ⅱ型膠原陽(yáng)性染色比生理鹽水對(duì)照組較深，全方組優(yōu)于三組拆方組。與龜鹿組對(duì)比，龜鹿參組與龜鹿杞組效果較佳，其中龜鹿杞組藥效更好。參照前期實(shí)驗(yàn)［7－9］，證實(shí)了君藥龜板和鹿角在促膠原合成藥效中發(fā)揮的作用，同時(shí)臣藥人參與枸杞能夠促進(jìn)君藥更好的發(fā)揮藥效，具備明顯的協(xié)同輔助作用。

有研究表明:枸杞提取液能顯著提高小鼠皮膚中SOD的活性，增加皮膚中膠原蛋白的含量［14］。枸杞多糖可以通過(guò)抑制腎臟內(nèi)IV型膠原的表達(dá)起到腎臟保護(hù)作用［15］?？梢?jiàn)枸杞對(duì)膠原的影響根據(jù)不同組織出現(xiàn)不同的結(jié)果。但前期研究顯示［9］，枸杞單獨(dú)并不能有效的促進(jìn)Ⅱ型膠原合成?？梢?jiàn)枸杞在方中起促進(jìn)君藥龜甲、鹿角藥效發(fā)揮的作用。其中人參雖然有促進(jìn)效果，但是不及枸杞，其在方中作用有待進(jìn)一步研究。

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