徐藝玫，劉 斌，史 深，燕順生，廖力夫

(新疆實(shí)驗(yàn)動物研究中心，烏魯木齊 830002)

鏡檢法在腹腔內(nèi)接種包蟲病動物模型中的應(yīng)用

徐藝玫，劉 斌，史 深，燕順生，廖力夫

(新疆實(shí)驗(yàn)動物研究中心，烏魯木齊 830002)

目的 建立一種簡單快速觀察腹腔內(nèi)接種包蟲病動物模型的方法。方法 按2000個(gè)原頭節(jié)/mL劑量，用多房棘球蚴對灰倉鼠進(jìn)行腹腔接種，采用肉眼觀察法和顯微鏡鏡檢法在第10天，15天，18天，22天，39天和60天觀察灰倉鼠腹腔內(nèi)包囊、包囊液和原頭節(jié)的生長情況;設(shè)空白對照組10只。結(jié)果 通過肉眼觀察和顯微鏡鏡檢，發(fā)現(xiàn)灰倉鼠在接種后的第18天有原頭蚴生長;第15天，18天和22天包囊增大、增多;第39天有成熟原頭節(jié)胚基生長;第60天有不同發(fā)育程度的原頭蚴。隨著接種時(shí)間的延長，包囊重量與傳代時(shí)間成正比。結(jié)論 本試驗(yàn)為制備包蟲病動物模型提供了簡單快速的觀察方法。

灰倉鼠;多房棘球蚴;原頭節(jié);診斷方法;模型，動物

包蟲病又稱棘球蚴病(echinococcosis)，是由棘球絳蟲的幼蟲寄生在人體內(nèi)引起的自然疫源性人畜共患病。多房棘球蚴(Echinococcus muhilocularis E.m)系多房棘球絳蟲的幼蟲，是人獸共患多房棘球蚴病的病原體，具有外向增生包囊的特點(diǎn)，因此，被寄生的器官組織由于蟲體不斷外向增殖而遭受嚴(yán)重破壞，而且原頭節(jié)還可經(jīng)淋巴、血行轉(zhuǎn)移擴(kuò)散并移植;棘球蚴不僅壓迫組織器官造成其嚴(yán)重的變形，而且由于包囊破裂，囊液導(dǎo)致再感染或過敏性疾病，給人造成嚴(yán)重的病癥，甚至死亡。據(jù)估算我國有60～130萬的棘球蚴病患者，僅新疆縣級以上醫(yī)院有記載的年包蟲病手術(shù)病例最高年份約為2000例，以此推算，每年手術(shù)費(fèi)用就高達(dá) 600萬元［1］。包蟲病給患者及其家庭帶來極大的痛苦和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［2］。在包蟲病高流行地區(qū)，包蟲病已成為制約當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展、影響社會安定的公共衛(wèi)生問題［3］。本研究通過包蟲病動物模型鏡檢觀察，建立動物模型的快速診斷方法，為探索包蟲病動物模型的感染機(jī)制、病理改變、治療效果評價(jià)等提供試驗(yàn)平臺。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

2～3 月齡，清潔級灰倉鼠［4］，體重 35～45 g，共56只，雌雄各半來源于新疆實(shí)驗(yàn)動物研究中心【生產(chǎn)許可證 SCXK(新)2011－0001】，【使用許可證SYXK(新)2003－0003】。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑

生物安全柜(BHC-1300IIA2)，顯微鏡，20目和40目不銹鋼濾網(wǎng)，研缽，酒精燈，小型干燥器，醫(yī)用棉花，雙抗生理鹽水(每毫升含青-鏈霉素各1000單位)、乙醚、酒精棉球、10%甲醛溶液、含氯消毒劑。

1.3 多房棘球蚴原頭節(jié)的制備［5.6］

多房棘球蚴蟲株采自新疆醫(yī)科大學(xué)多房棘球蚴病病人的 E.m，在生物安全柜內(nèi)無菌操作，對灰倉鼠采用腹腔接種的方法進(jìn)行傳代，飼養(yǎng)于IVC(獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng))內(nèi)。在生物安全柜內(nèi)行安樂術(shù)處死傳代接種5個(gè)月的灰倉鼠，使用固定解剖板，用酒精棉球擦拭頸部以下表皮和四肢，剖開灰倉鼠的腹部，取出包囊置于研缽內(nèi)的20目濾網(wǎng)上，剪碎研磨，用雙抗生理鹽水沖洗兩次，濾液經(jīng)40目網(wǎng)過濾，用生理鹽水從40目網(wǎng)的反方向沖洗下原頭節(jié)，沖洗液自然沉淀后棄上清，沉淀的原頭節(jié)用生理鹽水清洗三遍，除去沉淀較慢的死亡和活力不好的原頭節(jié)，制成原頭節(jié)懸液。顯微鏡下觀察混勻的原頭節(jié)活動情況，用洋紅染液排斥實(shí)驗(yàn)法檢查原頭節(jié)活力在80%以上，并計(jì)數(shù)調(diào)整，使原頭節(jié)濃度為5000個(gè)原頭節(jié)/毫升左右，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 接種和實(shí)驗(yàn)方法［7］

按2000個(gè)原頭節(jié)/只的劑量腹腔注射接種灰倉鼠，用1mL注射器，12號注射針頭抽取搖勻的原頭節(jié)懸液，每只0.4mL，共48只，對照組動物腹腔接種0.5mL生理鹽水。分別于接種后的第10天，15天，18天，22天和39天行安樂術(shù)處死接種動物，對照組和60 d組同步處理，剖檢動物，取其腹腔內(nèi)的包囊，稱量包囊和動物體重、肉眼觀察、測量、計(jì)數(shù)和鏡檢。

1.5 包蟲病動物模型的檢測觀察方法

肉眼觀察包囊內(nèi)是否有小白點(diǎn)，通過顯微鏡觀察每組實(shí)驗(yàn)處理的包囊，觀察包囊液內(nèi)是否有原頭節(jié)、包囊生成時(shí)間和原頭節(jié)生成時(shí)間，包囊生長階段，計(jì)算包囊系數(shù)(包囊重/體重×100%)，包囊浸泡于10%甲醛溶液中用于原頭節(jié)觀察、拍照、計(jì)算動物感染率、觀察感染包囊發(fā)育狀況。

2 結(jié)果

2.1 原頭蚴接種動物的感染狀況

腹腔接種48只，有效接種46只，感染43只。接種10 d組和60 d組各有一只動物分別于接種后的第2天和第3天死亡，解剖后未見腹腔內(nèi)有包囊樣結(jié)構(gòu)，其它存活灰倉鼠隨著接種時(shí)間的延長腹部逐漸增大，行動遲緩，精神萎靡;10d組中7只灰倉鼠有1只雄鼠剖檢后沒有發(fā)現(xiàn)包囊，感染率85.7%(6/7);15d組中2只雄鼠未發(fā)現(xiàn)包囊，感染率50%，4只雌性全部有包囊，雌性感染率高于雄性，總感染率 75%(6/8);18d、22d、39d和60d組雌雄灰倉鼠腹腔內(nèi)均有E.m感染，感染率100%(表1)。空白對照組灰倉鼠同期于喂養(yǎng)60d內(nèi)剖檢，腹腔內(nèi)未見囊泡樣結(jié)構(gòu)。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察［8］

解剖接種10 d組的7只動物，6只腹腔內(nèi)有數(shù)量不多的包囊，包囊成透明空泡狀，多為散在的小包囊，肉眼觀察包囊內(nèi)無白點(diǎn)，經(jīng)40倍顯微鏡鏡檢觀察無原頭節(jié)生長(圖1);解剖接種15 d組的8只動物，6只腹腔內(nèi)有包囊，包囊數(shù)量較10 d組多，包囊成透明空泡狀，散在的小包囊增多，肉眼觀察包囊內(nèi)無白點(diǎn)，經(jīng)鏡檢觀察無原頭節(jié)生長(圖2);解剖接種18 d組，8只灰倉鼠腹腔內(nèi)都有包囊，包囊數(shù)量增多，包囊成大的透明空泡狀，散在的小包囊增多，肉眼觀察包囊內(nèi)有白點(diǎn)(圖3)，鏡檢觀察有原頭節(jié)生長(圖7);解剖接種22 d組，8只灰倉鼠腹腔內(nèi)包囊數(shù)量大而多，肉眼觀察包囊內(nèi)壁分布有許多小白點(diǎn)(圖4)，鏡檢觀察有原頭節(jié);接種39 d組的灰倉鼠，腹腔內(nèi)有數(shù)量更多的大、小包囊，肉眼觀察包囊內(nèi)壁分布有許多小白點(diǎn)(圖5，9)，幾乎每個(gè)包囊都有原頭節(jié)，鏡檢觀察原頭節(jié)數(shù)量隨接種時(shí)間延長明顯增多。60 d組后的灰倉鼠有不同發(fā)育程度的原頭節(jié)生長(圖6，10)。

2.3 包囊和原頭節(jié)的生長情況［5;6;9］

從灰倉鼠體內(nèi)取出包囊分別稱重顯示(表1)，隨著接種周期的延長，包囊的重量和包囊系數(shù)成正比增長，原頭節(jié)數(shù)量增多。根據(jù)不同的階段觀察多房棘球蚴在灰倉鼠腹腔的生長發(fā)育規(guī)律，對灰倉鼠感染10 d、15 d的包囊生長發(fā)育狀態(tài)比較結(jié)果顯示，有包囊生長，包囊囊重由0.97 mg增加至14 mg，囊重占體重比0.0131%～0.13%，顯微鏡鏡檢未發(fā)現(xiàn)原頭節(jié)形成，第18天時(shí)，顯微鏡鏡檢有原頭節(jié)出現(xiàn);39 d后，肉眼觀察灰倉鼠腹腔內(nèi)有葡萄串樣囊狀物，有更多的包囊生長，呈乳白色、圓形、直徑大小不等，包囊內(nèi)壁分布有豐富的小白點(diǎn);60 d后，包囊生長速度加快，有大量原頭節(jié)自殖，使包囊外觀囊泡狀轉(zhuǎn)變成團(tuán)霧狀，經(jīng)顯微鏡觀察有原頭節(jié)生長，多至為100余個(gè)包囊，隨著接種時(shí)間的延長，接種感染的包囊多附著于腹腔臟器表面或漿膜表面，包囊的大小及數(shù)量與包囊生長時(shí)間有一定的相關(guān)性。

表1 表1 包囊重量、數(shù)量和原頭節(jié)數(shù)量的結(jié)果Tab.1 Results of the cyst weight，quantity，and the number of protoscoleces

3 討論

理想動物模型的制備，是包蟲病各項(xiàng)研究工作的基礎(chǔ)。目前包蟲病動物模型的效果評價(jià)多以包囊系數(shù)和病理切片結(jié)果作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，由于制備病理切片工作程序復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期長，成本高，制備出的病理切片能在顯微鏡下觀察到原頭節(jié)的切片數(shù)不多，因此，需要探討簡單快速的方法評價(jià)包蟲病動物模型的效果。

本研究通過對灰倉鼠感染多房棘球蚴病動物模型的建立，探索多房棘球蚴在灰倉鼠腹腔內(nèi)各個(gè)發(fā)育階段的生長規(guī)律，為尋求快速判斷包蟲病動物模型建立方法。應(yīng)用多房棘球蚴接種灰倉鼠腹腔，分階段觀察、鏡檢，可在較短的實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)判斷動物有無感染多房棘球蚴、在顯微鏡下觀察包囊內(nèi)是否有原頭節(jié)生長、原頭節(jié)在各個(gè)生長周期的發(fā)育情況等，這些都可以作為評判包蟲病動物模型的指標(biāo)。

通過外觀肉眼觀察有棘球蚴包囊生長、顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)有原頭節(jié)生長，或許可以作為一個(gè)快速檢測包蟲病動物模型的方法，但更重要的是能及時(shí)觀察到原頭節(jié)的生長發(fā)育狀況、感染效果和感染率，為建立灰倉鼠多房棘球蚴動物模型奠定有效的檢測方法。

彩圖如下［8］:

圖1 接種多房棘球蚴蟲株10天后，灰倉鼠腹腔內(nèi)的包囊生長情況Fig.1 After multilocular echinococcus were intraperitoneally inoculated in the C.migratorus，observed the growth of intraperioneal cyst in the 10 days

圖2 接種15天后腹腔內(nèi)包囊生長情況Fig.2 After inoculating，observed the growth of intraperioneal cyst in the 15 days

圖3 接種18天后腹腔內(nèi)包囊生長情況Fig.3 After inoculating，observed the growth of intraperioneal cyst in the 18 days

圖4 圖4 接種22天后腹腔內(nèi)包囊生長情況Fig.4 After inoculating，observed the growth of intraperioneal cyst in the 22 days

圖5 圖5 接種39天后腹腔內(nèi)包囊生長情況Fig.5 After inoculating，observed the growth of intraperioneal cyst in the 39 days

圖6 圖6 接種60天后腹腔內(nèi)包囊生長情況Fig.6 After inoculating，observed the growth of intraperioneal cyst in the 60 days

圖7 顯微鏡觀察接種18天后腹腔內(nèi)包囊內(nèi)原頭節(jié)生長情況Fig.7 After inoculating，observed the growth of intraperioneal Protcoscolex with the microscope in the 18 days

圖8 顯微鏡觀察接種22天后腹腔內(nèi)包囊內(nèi)原頭節(jié)生長情況Fig.8 After inoculating，observed the growth of intraperioneal Protcoscolex with the microscope in the 22 days

圖9 顯微鏡觀察接種39天后腹腔內(nèi)包囊內(nèi)原頭節(jié)生長情況Fig.9 After inoculating，observed the growth of intraperioneal Protcoscolex with the microscope in the 39 days

圖10 顯微鏡觀察接種60天后腹腔內(nèi)包囊內(nèi)原頭節(jié)生長情況Fig.10 After inoculating，observed the growth of intraperioneal Protcoscolex with the microscope in the 60 days

［1］謝增如，，溫浩，等.骨細(xì)粒棘球蚴病動物模型的建立［J］.中國寄生蟲病防治雜志，2005，18(2):127－128.

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［3］張靜，葉彬，鄒曉毅，等.異源接種建立小鼠和兔包蟲病動物模型的初步探討［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33(7):679－681.

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Application of Microscopic Examination in Animal Models of Intraperitoneal Inoculating the Echinococcosis

XU Yi-mei，LIU Bin，SHI Shen，YAN Shun-sheng，LIAO Li-fu
(Xinjiang Laboratory Animal Research Center，Urumqi 830002，China)

Objective This study was designed to establish a simple and rapid methods for observing animal models of echinococcosis.Methods Multilocular echinococcus in a dose of 2000 protoscolex/mL were intraperitoneally inoculated in the C.migratorus.Using a simple visual observation and microscopic examination method，the growth of intraperioneal cyst，cyst fluid and protoscoleces was observed in the 10d，15d，18d，22d，39d and 60d after inoculation.Results Protoscoles were found in the 18d，and cysts became big and many in the 15d，18d and 22d.There was protoscoles blastemal growth in the 39d.Different degree of protoscolex was developed in the 60d.With the extension of the inoculation time，the cyst weight increased.Conclusion The methods for examination of animal models of echinococcosis were established.

C.migratorus;Cyst;Protcoscolex;Diagnostic method;Model animal

Q-95 R332

A

1671-7856(2012)09-0058-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.009.013

2012-08-28

國家“十一五”科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2009BAI83B02)。

徐藝玫(1973－)，女，副研究員，研究方向:動物實(shí)驗(yàn)與管理。E-mail:xymeimei@163.com。

廖力夫(1957－)，男，研究員，主要從事醫(yī)學(xué)動物昆蟲及應(yīng)用研究。