唐 堯，崔洪光，趙龍鉉,3,*

（1.遼寧師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，遼寧 大連 116029；2.大連大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116622；3.遼寧師范大學(xué) 生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)遼寧省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116029）

1 引言

齊墩果酸(Oleanolic Acid，OA)是一種齊墩果烷型五環(huán)三萜類化合物，是多種天然產(chǎn)物的主要功能成分，在自然界中分布廣泛，如在青葉膽全草、白花蛇舌草、女貞果實(shí)等植物中以游離形式存在或與糖結(jié)合成苷存在。顯示出多種生物活性：如抗腫瘤[1-3]、抗炎[4,5]、抗病毒[6]、抗高血脂[7,8]、降血糖[9]等藥理作用。OA是治療急性黃膽型肝炎和慢性病毒性肝炎[10]比較理想的藥物，且毒性低，不良反應(yīng)少。由于其藥理活性較多，副作用和細(xì)胞毒性相對(duì)較低，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)齊墩果酸的提取、含量測(cè)定和藥理活性等方面做了大量的研究工作。部分研究小組也對(duì)其衍生物的抗腫瘤和抗艾滋病活性進(jìn)行了研究。

圖1 OA的結(jié)構(gòu)

為了進(jìn)一步研究齊墩果酸的結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系，本文以O(shè)A為先導(dǎo)化合物，以有機(jī)合成技術(shù)為手段，對(duì)齊墩果酸的3位進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，并開發(fā)了丁二酸連接片段，將其與多種氨基酸及其它的活性片段進(jìn)行了偶聯(lián)，氨基酸的引入有望提高藥物的選擇性及水溶性。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器和試劑

WGH-30雙光束紅外分光光度計(jì)測(cè)定，KBr壓片；Varian-400MHz核磁共振儀，BRUKER-500MHz核磁共振儀，CDCl3為溶劑；X-5顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀（控溫型），溫度未經(jīng)校正；所用試劑均為分析純或化學(xué)純。

2.2 齊墩果酸甲酯(O-1)的合成與表征

在250 mL的圓底燒瓶中加入OA(5 g，10.94 mmol)和無(wú)水 K2CO3(3.78 g，27.35 mmol)，再加入干燥的 DMF(50 mL)，攪拌下慢慢加入CH3I(1.37 mL，21.89 mmol)，常溫下攪拌6 h，反應(yīng)完畢后用水稀釋，用1N的鹽酸洗滌至微酸性，再用水洗滌至中性，并用飽和氯化鈉洗滌，所得有機(jī)相用無(wú)水硫酸鎂干燥，過濾，減壓蒸餾得粗產(chǎn)物，再用乙酸乙酯/石油醚(1:5，V:V)作洗脫劑進(jìn)行加壓柱層析，分離得到白色固體 O-1：齊墩果酸甲酯。產(chǎn)量：5 g，產(chǎn)率：97%，熔點(diǎn)：197～198℃；IR(KBr): 3348, 2948, 1728, 1426 cm-1；1H NMR(400 MHz, CDCl3): δ 5.27(t, J=3.6Hz, 1H,H-12), 3.61(s, 3H, OCH3), 3.20(dd, J =10.4 Hz, 5.2 Hz, 1H, H-3), 2.85(dd, J=14.0 Hz, 4.0 Hz, 1H,H-18), 1.12, 0.98, 0.92, 0.90, 0.89, 0.77, 0.72(s,each 3H, -CH3).

圖2 齊墩果酸衍生物的合成路線

2.3 3β-O-羧丙?；?齊墩果酸甲酯(O-2)的合成與表征

2.4 3β-O-(4-乙酰氨基)-苯氧-丁二酰基-齊墩果酸甲酯(O-3a)的合成與表征

2.5 3β-O-(1-甲氧羰基)-乙氨基-丁二?；?齊墩果酸甲酯(O-3b)的合成與表征

將 O-2(100 mg，0.175 mmol)、H-Ala-OMe·HCl(30 mg，0.21 mmol)、DMAP(26 mg，0.21 mmol)和CH2Cl2(3mL)依次加入100 mL圓底燒瓶中，將反應(yīng)液冷卻至0℃，再將EDCI(40 mg，0.21 mmol)溶于CH2Cl2(3 mL)中，在攪拌下逐滴加入反應(yīng)瓶中，滴加完畢后再在0℃下攪拌5 min，室溫?cái)嚢? h，反應(yīng)完畢后，用CH2Cl2提取，并用水和飽和 NaCl溶液洗滌，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鎂干燥，過濾，減壓蒸餾除去溶劑得粗產(chǎn)物，再用乙酸乙酯/石油醚(1:2，V:V)作洗脫劑進(jìn)行加壓柱層析，分離得到白色固體 O-3b：3β-O-(1-甲氧羰基)-乙氨基-丁二?；?齊墩果酸甲酯。產(chǎn)量：104 mg，產(chǎn)率：90%，熔點(diǎn)：76.6～79.0℃；IR(KBr): 3272,2947, 1730, 1651, 1551, 1166cm-1；1H NMR(500Hz,CDCl3): δ 6.2(d, J=7.2Hz, 1H, -NH), 5.29(t,J=3.55Hz, 1H, H-12), 4.59(m, 1H, -COCHNH-),4.52(dd, J=9.1Hz, 7.15Hz, 1H, H-3), 3.75(s, 3H, 丙氨酸基團(tuán)上的-OCH3), 3.63(s, 3H, -OCH3),2.87(dd, J=13.9Hz, 4.3Hz, 1H, H-18), 2.73-2.52(m,4H, -CH2CH2COOH), 1.41(d, J=7.15Hz, 3H,CH3CHN-), 1.14, 0.93, 0.92, 0.91, 0.87, 0.86, 0.74(s, each 3H, -CH3).

2.6 3β-O-(1-甲氧羰基)-異丁氨基-丁二酰基-齊墩果酸甲酯(O-3c)的合成與表征

按照實(shí)驗(yàn)方法 2.5由化合物 O-2(100 mg，0.175 mmol)和 H-Val-OMe·HCl (35 mg，0.21 mmol)反應(yīng)得到了白色固體 O-3c：3β-O-(1-甲氧羰基)-異丁氨基-丁二酰基-齊墩果酸甲酯。產(chǎn)量：112 mg，產(chǎn)率：93%，熔點(diǎn)：82.0～83.8℃；IR(KBr): 3408,2941, 1736, 1655, 1550, 1171cm-1；

1H NMR(500Hz, CDCl3): δ 6.21(d, J=8.65Hz,1H, -NH), 5.29(t, J=3.55Hz, 1H, H-12), 4.55(dd,J=8.7Hz, 4.95Hz, 1H, -COCH NH-), 4.53(dd, J=7.5 Hz, 1H, H-3), 3.74(s, 3H, 纈氨酸基上的-OCH3),3.64(s, 3H, -OCH3), 2.87(dd, J=13.85Hz, 4.3Hz, 1H,H-18), 2.70-2.54(m, 4H, -CH2CH2COOH),2.17-2.13(m, 1H, (CH3)2CHCHNH-), 0.86(d,J=3.35 Hz, 6H, (CH3)2-), 1.14, 0.95, 0.94, 0.93,0.92, 0.91, 0.73(s, each 3H, -CH3).

2.7 3β-O-(1-甲氧羰基)-苯乙氨基-丁二?；?齊墩果酸甲酯(O-3d)的合成與表征

按照實(shí)驗(yàn)方法 2.5由化合物 O-2(100 mg，0.175 mmol)和 H-Phe-OMe·HCl (45 mg，0.21 mmol)反應(yīng)得到了白色固體 O-3d：3β-O-(1-甲氧羰基)-苯乙氨基-丁二酰基-齊墩果酸甲酯。產(chǎn)量：105 mg，產(chǎn)率：82%，熔點(diǎn)：68.6～71.2℃；IR(KBr):3373, 2946, 1733, 1674, 1530, 1451, 1374, 1173,748, 700cm-1；1H NMR(500Hz, CDCl3): δ 7.32-7.24(m, 3H, -Ph), 7.12(d, J=6.8Hz, 2H, -Ph),6.1(d, J=7.65Hz, 1H, -NH), 5.29(t, J=3.5Hz, 1H,H-12), 4.88(m, 1H, PhCH2CHNH), 4.54(dd,J=8.9Hz, 7.05 Hz, 1H, H-3), 3.72(s, 3H, 苯丙氨酸基上的-OCH3), 3.64(s, 3H, -OCH3), 3.17-3.08(m,2H, PhCH2-), 2.87(dd, J=13.9Hz, 4.25Hz, 1H,H-18), 2.64(t, J=6.85Hz, 2H, -NCOCH2CH2-),2.50(t, J=6.85Hz, 2H, -NCOCH2CH2-), 1.14, 0.95,0.94, 0.91, 0.87, 0.86, 0.74 (s, each 3H, -CH3).

2.8 3β-O-(3β-O-齊墩果酸甲酯)-丁二?；?齊墩果酸甲酯(O-3e)的合成與表征

按照實(shí)驗(yàn)方法2.5由化合物O-2(80 mg，0.14 mmol)和 3β-羥基齊墩果烷-12-烯-28β-羧酸甲酯(66 mg，0.14 mmol)反應(yīng)得到了白色固體O-3e：3β-O-(3β-O-齊墩果酸甲酯)-丁二?；?齊墩果酸甲酯。產(chǎn)量：70 mg，產(chǎn)率：49%，熔點(diǎn)：219.6～222.1℃；IR(KBr): 2944, 1732, 1162cm-1；

1H NMR(500Hz, CDCl3): δ 5.29(t, J=3.5Hz,2H, H-12和OA基上的H-12′), 4.53(t, J=8.2Hz, 2H,H-3 和 OA 基上的 H-3′), 3.64(s, 6H, -OCH3),2.87(dd, J=13.9Hz, 4.25Hz, 2H, H-18和OA基上的 H-18′), 2.66-2.60(m, 4H, -OCOCH2CH2COO-),1.14, 0.94, 0.93, 0.91, 0.87, 0.86, 0.74 (s, each 6H,-CH3).

2.9 3β-O-(3β-O-熊果酸甲酯)-丁二?；?齊墩果酸甲酯(O-3f)的合成與表征

按照實(shí)驗(yàn)方法 2.5由化合物 O-2(100 mg，0.175 mmol)和 3β-羥基熊果烷-12-烯-28β-羧酸甲酯(83 mg，0.175 mmol)反應(yīng)得到了白色固體O-3f：3β-O-(3β-O-熊果酸甲酯)-丁二?；?齊墩果酸甲酯。產(chǎn)量：46 mg，產(chǎn)率：25.7%，熔點(diǎn)：228.0～230.0℃；IR(KBr): 2939, 1732, 1459, 1379,1170cm-1；1H NMR(500Hz, CDCl3): δ 5.27(t,J=3.5Hz, 1H, H-12), 5.24(t, J=3.5Hz, 1H, UA基上的 H-12′), 4.51(m, 2H, H-3和 UA 基上的 H-3′),3.61(s, 3H, -OCH3), 3.59(s, 3H, UA基上的-OCH3),2.85(dd, J=14Hz, 4.3Hz, 1H, H-18), 2.66-2.58(m,4H, -OCOCH2CH2COO-), 2.22(d, J=11.25Hz, 1H,UA基上的H-18′), 1.25, 1.12, 1.06, 0.94, 0.93, 0.89,0.74, 0.72 (s, each 3H, -CH3), 0.92, 0.86, 0.85(s,each 6H, -CH3).

2.10 3β-O-(3β-O-甘草次酸甲酯)-丁二?；?齊墩果酸甲酯(O-3g)的合成與表征

按照實(shí)驗(yàn)方法 2.5由化合物 O-2(100 mg，0.175 mmol)和甘草次酸甲酯(84.8 mg，0.175 mmol)反應(yīng)得到了白色固體 O-3g：3β-O-(3β-O-甘草次酸甲酯)-丁二?；?齊墩果酸甲酯。產(chǎn)量：34mg，產(chǎn)率：19%，熔點(diǎn)：149.0～151.0℃；IR(KBr):2945, 1727, 1460, 1380, 1258, 1162cm-1；1H NMR(500Hz, CDCl3): δ 5.66(s, 1H, GA 基上的H-12′), 5.27(t, J=3.45Hz, 1H, H-12), 4.56-4.50(m,2H, H-3和GA基上的H-3′), 3.68(s, 3H, GA基上的-OCH3), 3.62(s, 3H, -OCH3), 2.85(dd, J=13.95Hz,4.25Hz, 1H, H-18), 2.79(dt, J=13.65Hz, 3.4Hz, 1H,GA 基 上 的 H-18′), 2.67-2.57(m, 4H,-OCOCH2CH2COO-), 2.35(s, 1H, GA基上的 H-9′),1.35, 1.15, 1.14, 0.89, 0.88, 0.87, 0.86, 0.85, 0.80,0.72(s, each 3H, -CH3), 1.12, 0.92 (s, each 6H,-CH3).

3 結(jié)果與討論

我們做了以下工作：(1)首先以齊墩果酸為起始原料，在DMF溶劑中，K2CO3作用下與CH3I反應(yīng)得到 C-28位羧酸甲酯化的產(chǎn)物齊墩果酸甲酯。（2）在 CH2Cl2中，DMAP作用下與丁二酸酐反應(yīng)得到齊墩果酸3β-O-羧丙?；?齊墩果酸甲酯。（3）3β-O-羧丙酰基-齊墩果酸甲酯與一系列化合物在DMAP和EDCI催化下偶合得到一系列齊墩果酸衍生物 3β-O-(4-乙酰氨基)-苯氧-丁二?；?齊墩果酸甲酯、3β-O-(1-甲氧羰基)-乙氨基-丁二?；?齊墩果酸甲酯等7種齊墩果酸衍生物。

4 結(jié)論

本文通過對(duì)齊墩果酸的結(jié)構(gòu)改造，合成了 3種齊墩果酸的氨基酸衍生物及其它4種偶聯(lián)產(chǎn)物，對(duì)所合成的化合物通過IR及1H NMR進(jìn)行了確證。齊墩果本身具有較好的臨床藥理活性，經(jīng)過與氨基酸及其它活性片段的拼合，有望起到協(xié)同作用，進(jìn)一步提高其生物活性和生物利用度。相關(guān)的活性測(cè)試正在進(jìn)行中。

[1]黃煒, 黃濟(jì)群, 張東方. 五環(huán)三萜類化合物抗人肺癌細(xì)胞侵襲和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究[J]. 中國(guó)肺癌雜志,2003, 6(4): 254-257.

[2]黃志勤, 李洪亮, 孫立波. 齊墩果酸抗大鼠移植性肝癌作用的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(18):10807-10808.

[3]孫華, 胡春, 方唯碩. 3-氧代齊墩果酸氨基酸偶聯(lián)物的合成、水溶性的測(cè)定及抗腫瘤活性研究[J]. 中國(guó)藥物化學(xué)雜志, 2008, 18(1): 11-15.

[4]AKIHISAT, KAMO S, UCHIYAMA T, et al. Cytotoxic activity ofPerilla frutescensvar.japonicaleaf extract is due to high concentrations of oleanolic and ursolic acids[J]. J Nat Med, 2006, 60(4): 331-333.

[5]LI W, DAS S, NG K, et al. Formulation, biological and pharmacokinetic studies of sucrose ester-stabilized nanosuspensions of oleanolic acid[J]. Pharm Res 2011,28(8): 2020–2033.

[6]李群林, 顧軍, 李靈芝. 齊墩果酸衍生物的合成[J].合成化學(xué), 2010, 18(3): 290-296.

[7]XI J, CHANG Q, CHAN C K, et al. Formulation development and bioavailability evaluation of a self-nanoemulsified drug delivery system of oleanolic acid[J]. AAPS PharmSciTech, 2009, 10(1): 172-182

[8]SEEBACHER W, WEIS R, JURENITSCH J, et al.Synthesis and haemolytic activity of oleanolic acid trisaccharides [J]. Monatshefte für Chemie, 1999, 130(11): 1383-1391.

[9]田麗婷, 馬龍, 堵年生. 齊墩果酸的藥理作用研究概況[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2002, 27(12): 884-901.

[10]王立新, 韓廣軒, 劉文庸. 齊墩果酸的化學(xué)及藥理研究[J]. 藥學(xué)實(shí)踐雜志, 2001, 19(2): 104-107.