馬 偉 賈艷姝 李 娜 龔 賀 張艷賀

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱，150040)

蒙古黃芪［Astragalus membranaceus(Fish.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao］為名貴中藥材。但目前對其過度的采挖，已造成傳統(tǒng)道地黃芪已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場需求［1－2］。因此從天然藥用微生物的角度出發(fā)，分離有價(jià)值的黃芪內(nèi)生真菌對保護(hù)野生資源具有重要意義［3－7］。

1 材料與方法

1.1 儀器及試藥

試驗(yàn)儀器:FA2004型電子分析天平(上海良平儀器儀表有限公司);DZKW－C型儀表恒溫不銹鋼水浴鍋(上海樹立儀器儀表有限公司);手提式壓力鍋(上海申安醫(yī)療器械廠);CLASSⅡTYPE B2潔凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);HZQF160震蕩培養(yǎng)箱(中國哈爾濱市東聯(lián)電子科技開發(fā)有限公司);隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海－恒科技有限公司);Nikon－80i顯微鏡(JAPAN);平板培養(yǎng)皿、三角瓶(上海五一玻璃儀器廠)。

試驗(yàn)試藥:牛肉膏、酵母提取物、胰化蛋白胨、蛋白胨、可溶性淀粉(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司);瓊脂(JAPAN.OXOID ENGLAND);葡萄糖(分析純，天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司);醫(yī)用酒精(齊齊哈爾市鶴城消毒劑廠)。

植物材料為蒙古黃芪［Astragalus membranaceus(Fish.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao］的健康植株，采集時間為2009年10月，采集地點(diǎn)為黑龍江省農(nóng)科院園藝分院黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)黃芪試驗(yàn)田。

1.2 方法

1.2.1 試劑的制備

PDA(A)——PDA粉末與蒸餾水配制而成;牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(B)——牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCI 5 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH=7.4 ～7.6;LB(Luria－Bertani)固體培養(yǎng)基(C)——胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g;高氏 I號培養(yǎng)基(D)——可溶性淀粉 20 g，KNO 31 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蒸餾水1000 mL，瓊脂20 g，pH=7.4 ～7.6。

1.2.2 內(nèi)生真菌的分離純化及培養(yǎng)基的篩選

組織培養(yǎng):選擇無病斑新鮮黃芪根塊沖洗干凈，晾至表面無水珠，取主根切成約3 cm長的小段，注意保持切口的整齊。

培養(yǎng)組織表面消毒:自來水沖洗干凈，75%乙醇漂洗3 min，無菌水沖洗3次，10%的次氯酸鈉溶液浸泡7 min，無菌水沖洗3次，每次2 min。為檢查材料表面消毒是否徹底做對照實(shí)驗(yàn)如下:①接組織塊:將與上述同樣條件處理過的根段不作分割，直接種植在4種培養(yǎng)基平皿上，置于相同條件下培養(yǎng);②接洗滌水:將最后一次清洗消毒組織塊的無菌水0.1 mL涂于4種培養(yǎng)基表面，置于相同條件下培養(yǎng)，③直接印跡:將與上述同樣條件處理過的根段直接在4種培養(yǎng)基表面做印跡。

培養(yǎng)基的選擇:將上述處理過的根段在無菌條件下切去兩端，剩余部分分割成小片，隨機(jī)將小片分別種植于4種培養(yǎng)基平板上，每種培養(yǎng)基設(shè)3個平行皿，每皿4片，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d，并以4種空白培養(yǎng)基做對照?？瞻讓φ兆?種處理，一是不做任何處理;二是將培養(yǎng)基內(nèi)接入消毒時要使用的同等條件下滅菌的無菌水少許;三是在消毒操作過程中，將倒入培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿開蓋暴露于超凈臺內(nèi)，目的是為了驗(yàn)證培養(yǎng)基、無菌水和超凈臺滅菌是否徹底。

分離菌的培養(yǎng):觀察實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)皿及對照皿情況，隨時觀察出菌情況及組織片變化，待根組織邊緣長出菌后，挑取菌絲或菌體，經(jīng)平板劃線法和平板稀釋法反復(fù)分離、純化，培養(yǎng)觀察菌落的形態(tài)，比較4種培養(yǎng)基對黃芪內(nèi)生真菌的分離情況，并對菌落的生長及特征做相應(yīng)的記錄。將所得菌株編號，轉(zhuǎn)入相應(yīng)斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，放入4℃冰箱短期保藏，備用。

1.2.3 內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

采用濕室法制備標(biāo)本片:對培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、鑷子、蒸餾水、PDA培養(yǎng)基等試劑和器皿進(jìn)行消毒滅菌處理，在培養(yǎng)皿中放入兩片蓋玻片(距離約為10 mm)，并放入無菌水適量，備用。在固體培養(yǎng)基尚未凝固前，用蓋玻片沾取培養(yǎng)基，使其表面形成一層薄的培養(yǎng)基;并將蓋玻片置于培養(yǎng)皿中的蓋玻片上，形成橋狀。挑取少量待測菌株菌絲，接種于蓋玻片上，培養(yǎng)2～3 d，將蓋玻片轉(zhuǎn)移到滅菌的載玻片上鏡檢觀察并拍攝顯微圖像。根據(jù)菌株的培養(yǎng)性狀和顯微圖像，結(jié)合真菌分類鑒定相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行初步分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 表面消毒效果

實(shí)驗(yàn)確定了黃芪根塊的最佳表面消毒方式，即先在75%乙醇中漂洗3 min，后用10%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒7 min，空白對照應(yīng)選擇印跡法或接洗滌水法。在上述表面消毒操作中，所有空白培養(yǎng)基及印跡法和接洗滌水法在整個觀察過程中均未染菌;而接組織塊法中，在第5天后，組織塊兩端有時會有菌長出。

2.2 培養(yǎng)基的選擇

在上述分離純化操作中，在PDA培養(yǎng)基中得到內(nèi)生真菌19株，LB(Luria－Bertani)固體培養(yǎng)基中得到內(nèi)生真菌6株，高氏I號培養(yǎng)基中得到內(nèi)生真菌1株，牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中得到內(nèi)生真菌2株;菌株在PDA培養(yǎng)基中長勢最好，且分離得到的內(nèi)生真菌數(shù)量最多(表1)。用4種不同的培養(yǎng)基進(jìn)行黃芪內(nèi)生真菌的分離時，PDA培養(yǎng)基無論是在提取菌的數(shù)量上，還是在菌的生長狀態(tài)上都要明顯好于其他3種培養(yǎng)基。因此，確定PDA培養(yǎng)基為本實(shí)驗(yàn)最佳的提取分離黃芪內(nèi)生真菌的培養(yǎng)基。

表1 各菌株在各自提取培養(yǎng)基上培養(yǎng)96 h時的菌落形態(tài)特征

3 結(jié)論與討論

本研究共從黃芪根塊中共分離出28株內(nèi)生真菌，采用形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方式，對所有的內(nèi)生真菌進(jìn)行了分類鑒定。結(jié)果在28株黃芪內(nèi)生菌中，鐮孢菌屬19株，生赤殼屬3株，裸胞殼屬2株，枝穂霉屬、枝頂孢屬、青霉屬及曲霉屬各1株。

在材料表面消毒過程中，用同樣操作方法對材料表面消毒后，采取3種不同的方法驗(yàn)證表面消毒效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，印跡法和接洗滌水法在整個培養(yǎng)過程中均未染菌，而接組織塊法中，在第5天后，組織塊兩端有時會有菌長出。如果其他操作不變，將次氯酸鈉消毒時間延長至10 min時，)組織塊兩端依然會有不同程度染菌。因此，這不能表明表面消毒不徹底。接組織塊在第5天后兩端染菌，原因可能是表面消毒過程中，消毒液使組織塊失活或部分失活，加之材料經(jīng)過了連續(xù)5 d 28℃的培養(yǎng)，導(dǎo)致組織塊內(nèi)部水分或其他液體從組織塊兩端滲出，材料中的內(nèi)生菌也隨之外滲，使組織塊兩端染菌。因此，在提取內(nèi)生菌的研究中，根據(jù)材料的不同，采用合理的表面消毒效果驗(yàn)證方法，對于保證內(nèi)生菌提取的數(shù)量和質(zhì)量具有重要意義。本試驗(yàn)研究表明，驗(yàn)證蒙古黃芪根塊表面消毒效果采用印跡法和接洗滌水法效果較好。

在內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定過程中，采用濕室法制片后，鏡下觀察時沒有加蓋蓋玻片，有效地保護(hù)了菌絲和孢子的形態(tài)結(jié)構(gòu)，取得良好的觀察效果。

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