陳明生

（山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局，山東諸城 262200）

染鋁對(duì)大鼠肝臟結(jié)構(gòu)及肝臟鐵、鋅、銅元素的影響的研究

陳明生

（山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局，山東諸城 262200）

以110g～120g Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以飲用AlCl3水溶液的方式構(gòu)建亞慢性染鋁大鼠模型，實(shí)驗(yàn)期120d。通過(guò)對(duì)大鼠臨床癥狀及體重、肝臟臟器系數(shù)、肝功能酶、肝臟生化指標(biāo)、氧化與抗氧化功能、肝臟元素含量、肝細(xì)胞凋亡及凋亡基因蛋白和mRNA表達(dá)量的檢測(cè)，結(jié)合肝臟顯微和超微結(jié)構(gòu)觀察，探討染鋁對(duì)肝臟毒性作用的機(jī)制，為鋁毒性的研究和鋁毒害的解除提供基礎(chǔ)資料。

大鼠 染鋁 肝臟 損傷

1 染鋁對(duì)大鼠肝臟結(jié)構(gòu)的影響

1.1 研究?jī)?nèi)容和實(shí)驗(yàn)方案

染鋁120d對(duì)各組大鼠稱重，斷頭處死大鼠，收集血液于潔凈試管，3000r/min離心10min析出血清，標(biāo)記分裝，-70℃冷凍保存?？焖偃〕龈闻K，用預(yù)冷的生理鹽水沖去血漬，去除表面結(jié)締組織，濾紙擦干，分析天平稱重，檢測(cè)肝臟臟器系數(shù)；用刀片迅速選取2mm×2mm×2mm大小的肝臟組織，固定于pH7.2的2.5%戊二醛磷酸鹽沖液固定，4℃保存，用于肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察；選取5mm×5mm×3mm大小的肝臟組織固定于10%福爾馬林磷酸鹽緩沖液中，用于普通病理組織學(xué)觀察。

1.2 結(jié)果

對(duì)照組肝細(xì)胞胞漿豐富，核膜完整，核圓，核仁清晰，染色質(zhì)均勻分布，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)豐富的線粒體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體大小均勻，結(jié)構(gòu)清晰，基質(zhì)豐富，呈板層分布，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上富含核糖體，周?chē)麧{內(nèi)可見(jiàn)大量糖原顆粒，高爾基體清晰可見(jiàn)。染鋁組大鼠肝細(xì)胞核形態(tài)異常，核皺縮，核膜內(nèi)陷，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器相對(duì)減少，溶酶體增多，脂滴增多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，線粒體腫脹、變圓，排列紊亂，板層減少，線粒體嵴模糊甚至消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少并脫顆粒，溶酶體增生。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索走向正常，中央靜脈周?chē)母渭?xì)胞索和肝血竇呈放射狀排列。肝細(xì)胞呈多邊形，結(jié)構(gòu)完好，排列緊密，細(xì)胞和細(xì)胞核輪廓清晰，核膜完整，細(xì)胞核大而圓，核染色質(zhì)稀疏淡染，核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)豐富；肝臟超微結(jié)構(gòu)觀察可知，肝細(xì)胞胞漿豐富，染色質(zhì)均勻分布，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)豐富的線粒體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體大小均勻，結(jié)構(gòu)清晰，基質(zhì)豐富，呈板層分布，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上富含核糖體，周?chē)麧{內(nèi)可見(jiàn)大量糖原顆粒，高爾基體清晰可見(jiàn)。而染鋁組大鼠隨著染毒劑量的增加，大鼠肝臟體積明顯縮小，與周?chē)M織粘連，肝小葉結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞脂肪變性，脂滴增多，肝血竇中有大量紅細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞排列紊亂，部分區(qū)域肝細(xì)胞胞漿透明，呈氣球樣變性，細(xì)胞核固縮、碎裂或溶解，超微結(jié)構(gòu)觀察可知肝細(xì)胞核形態(tài)異常，核皺縮，核膜內(nèi)陷，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器相對(duì)減少，溶酶體增多，脂滴增多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，線粒體腫脹、變圓，排列紊亂，板層減少，線粒體嵴模糊甚至消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少并脫顆粒，溶酶體增生。這表明長(zhǎng)期染鋁對(duì)肝細(xì)胞具有毒性作用，導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生組織形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)改變，損傷肝臟結(jié)構(gòu)。這與本實(shí)驗(yàn)另一結(jié)果血清ALT和AST活性升高相符合。

2 染鋁對(duì)肝臟鐵、鋅、銅元素的影響

2.1 研究?jī)?nèi)容和實(shí)驗(yàn)方案

（1）取出凍存組織，準(zhǔn)確稱取肝臟樣品0.5g，置于干凈平皿上剪碎至綠豆粒大小，放入80℃烘箱內(nèi)烘干12h后，置于三角燒瓶?jī)?nèi)，加入25ml體積比為4：1硝酸和高氯酸消化混合液，放置過(guò)夜。次日在電熱爐上緩慢加熱使樣品完全溶解至溶液為無(wú)色透明為止，此時(shí)瓶?jī)?nèi)剩余液體約為2～3ml，稍冷卻后，轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶，用0.5%硝酸定容，置于4℃冰箱內(nèi)避光保存。

（2）取高純金屬鋁片1.0g置于200ml燒杯中，加入1∶1的鹽酸25ml溶解，待溶解后，沸水溶蒸至近干，蒸發(fā)過(guò)量鹽酸，冷卻后去離子水定容至100ml，制作鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液。取鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00ml、0.75ml、1.25ml、1.75ml、2.50ml，加2%（V/V）鹽酸溶液約10ml，加入0.5mol/L的TBAB2.5ml，用2%（V/V）鹽酸溶液定容至25.0ml，按儀器測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)量，繪制出鋁的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）Al采用石墨爐原子吸收分光光度法，測(cè)定線為309.3nm，火焰類型為空氣-乙炔焰，按儀器測(cè)定條件測(cè)量，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中鋁的含量。Zn、Cu、Fe采用火焰原子吸收分光光度法，鋅的測(cè)定線為213.9nm，銅的測(cè)定線為324.8nm，鐵的測(cè)定線為248.3nm，測(cè)定方法同鋁。

2.2 結(jié)果

隨鋁攝入量的增加，肝臟鐵、鋅含量逐漸下降，可能是進(jìn)入機(jī)體的鋁與鐵競(jìng)爭(zhēng)性地與鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合，從而使肝臟中鐵蛋白含量下降，同時(shí)隨肝鋁的富集，Al3+將Fe2+從細(xì)胞儲(chǔ)備位點(diǎn)取代出來(lái)，導(dǎo)致游離Fe2+濃度增加，從而促進(jìn)Fe2+介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化。

鐵是動(dòng)物體內(nèi)所必需的一種金屬元素，它廣泛參與機(jī)體內(nèi)氧運(yùn)輸、DNA合成以及電子傳遞等過(guò)程。肝臟是攝取和貯存鐵的主要器官，機(jī)體內(nèi)鐵主要以鐵蛋白的形式存在于肝臟中，肝細(xì)胞是循環(huán)轉(zhuǎn)鐵蛋白的主要來(lái)源，肝臟通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的調(diào)節(jié)，保持鐵代謝的平衡。鋅是細(xì)胞生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)合成、酶的產(chǎn)生和免疫系統(tǒng)所需的金屬礦物質(zhì)，是多種酶的重要組成成分，參與糖類、脂類、蛋白質(zhì)、核酸的合成和降解，是機(jī)體內(nèi)必需的微量元素之一。鋅具有重要的抗氧化作用，可以提高肝組織中被抑制的全部膠原酶的活性，鋅缺乏不僅影響細(xì)胞呼吸及體內(nèi)許多生化反應(yīng)的正常進(jìn)行，而且降低了體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的活性，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中肝細(xì)胞膜受損，加重肝細(xì)胞壞死。銅亦是體內(nèi)必需的微量元素，它可以和蛋白質(zhì)結(jié)合形成銅蛋白，具有保護(hù)細(xì)胞的功能，銅還是許多重要酶的組成部分或激活劑。本研究發(fā)現(xiàn)，染鋁組大鼠肝臟銅含量與對(duì)照組相比有所升高，可能是由于鋅和銅具有拮抗作用，肝臟鋅水平降低所引起的機(jī)體的一種代償性功能。

綜上所述，長(zhǎng)期染鋁可使大鼠肝臟鋁富集并進(jìn)而干擾肝中鐵、鋅、銅等元素的正常分布和功能，引起肝臟損傷，這可能是鋁的肝臟毒性的機(jī)制之一。