楊麗君 陳鐘

結(jié)直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在近年呈上升趨勢。早期缺乏特異的臨床表現(xiàn)，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移成為影響預(yù)后的主要因素。肝臟是結(jié)直腸癌血行轉(zhuǎn)移的最主要的靶器官[1]，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移是治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一，也是患者最主要的死亡原因[2]。目前仍缺乏預(yù)測結(jié)直腸癌病人術(shù)后生存率的可靠指標(biāo)。骨橋蛋白(OPN，osteopontin)是一種具有多種功能的分泌型鈣結(jié)合磷酸化糖蛋白，與腫瘤細(xì)胞生長、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9，Matrix metallopmteinase-9）可降解細(xì)胞外基質(zhì)和血管基底膜的蛋白酶，在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵性作用。但有關(guān)OPN和MMP-9在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中相互作用及與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究尚少。本研究通過檢測結(jié)直腸癌患者組織中OPN和MMP-9表達(dá)，探討二者在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 結(jié)腸、直腸癌組織取自腫瘤正中無壞死部分，約3mm×3mm大小，正常結(jié)直腸粘膜組織取自距腫瘤邊緣5cm以外結(jié)腸、直腸粘膜上皮，約3mm×3mm大小。標(biāo)本取自常州第七人民醫(yī)院、南通大學(xué)附屬醫(yī)院2008年5月至2011年7月結(jié)直腸癌外科手術(shù)標(biāo)本，病例資料完整，年齡40～80歲。結(jié)直腸癌60例，術(shù)后病理組織學(xué)類型確診為腺癌(男32例，女28例；結(jié)腸癌22例，直腸癌38例；分化程度：高分化13例、中分化32例，低分化15例；腫瘤大小(直徑)：＜5cm，31例，≥5cm，29例；無肝轉(zhuǎn)移30例，有肝轉(zhuǎn)移30例；Dukes分期A+B期28例，C+D期32例)。12例正常腸粘膜來自手術(shù)切除距腫瘤組織5cm以上結(jié)腸、直腸粘膜及非腫瘤病人的結(jié)腸、直腸粘膜手術(shù)切除標(biāo)本。肝轉(zhuǎn)移診斷主要依據(jù)B超、CT、剖腹探查及病理，所有病例術(shù)前均未行放、化療。

主要試劑：MMP-9 鼠抗人單克隆抗體SC-80205、OPN鼠抗人單克隆抗體 SC-21742等。

1.2 方法 采用LAB VISION 2D全自動(dòng)免疫組化染色儀，免疫組化PV-9000二步法進(jìn)行染色。

1.3 結(jié)果判斷 采用雙盲法，陽性表達(dá)的判斷按照Volm的標(biāo)準(zhǔn)。按著色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)計(jì)分,＜20%為0分,≥20%～＜50%為1分,≥50%為2分。按著色強(qiáng)度計(jì)分,無著色為0分,淡黃色顆粒為1分,棕黃色顆粒為2分。將著色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)計(jì)分與著色強(qiáng)度計(jì)分相乘,總計(jì)分0分為陰性(-),1～2分為弱陽性(+),4分為強(qiáng)陽性(++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各檢測指標(biāo)與病理參數(shù)率的比較采用χ2檢驗(yàn)和連續(xù)校正χ2檢驗(yàn)。肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)。取α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OPN、MMP-9的表達(dá) OPN、MMP-9在結(jié)直腸癌組織中陽性表達(dá)率分別為71.6% (43/60)、68.3%(41/60)，在正常粘膜上皮組織中弱表達(dá)分別為16.7%(1/12)、0%(0/12)。結(jié)直腸癌組和正常粘膜組中OPN、MMP-9的表達(dá)情況相互比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)（見表1）。OPN、MMP-9在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率分別為83.3%(25/30)、83.3%(25/30)，結(jié)直腸癌無肝轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率分別為60.0%(18/30)、53.3%(16/30)，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移組和無肝轉(zhuǎn)移組中OPN、MMP-9的表達(dá)情況相互比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)（見表2）。OPN、MMP-9在各種組織的陽性表達(dá)情況見圖1、圖2。

表1 正常組織、結(jié)直腸癌組織中OPN、MMP-9表達(dá)陽性率對(duì)比

表2 結(jié)直腸癌有無肝轉(zhuǎn)移分組中OPN、MMP-9表達(dá)陽性率對(duì)比

表3 結(jié)直腸癌組織中OPN、MMP-9表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.2 OPN、MMP-9的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系 OPN、MMP-9在結(jié)直腸癌的表達(dá)與患者的年齡、性別、部位及腫瘤大小、分化程度無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。OPN、MMP-9在有肝轉(zhuǎn)移組、Dukes C+D期組中的陽性表達(dá)率均高于相應(yīng)對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),60例結(jié)直腸癌中MMP-9的表達(dá)水平同腫瘤的分化程度的相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；（見表3）。

圖1 OPN在正常結(jié)腸直腸上皮組織(A)結(jié)直腸癌組織（B）中表達(dá)(DAB,×400)

圖2 MMP-9在正常結(jié)腸直腸上皮組織(A)結(jié)直腸癌組織（B）中表達(dá)(DAB,×400)

2.3 OPN、MMP-9蛋白陽性表達(dá)的相關(guān)性分析 分別觀察OPN和MMP-9蛋白在同一標(biāo)本中的表達(dá)情況。在共60例結(jié)直腸癌標(biāo)本中，OPN和MMP-9表達(dá)共同陽性為37例(61.67%)，共同陰性為9例(15%)，二者單獨(dú)陽性分別為8例和6例，相關(guān)分析表明在結(jié)直腸癌發(fā)展過程中OPN和MMP-9蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.447，P=0.001，P＜0.05),如表4所示。

表4 OPN與MMP-9蛋白陽性表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

OPN是最先從骨基質(zhì)中分離得到一種糖蛋白，它可以抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞黏附、參與免疫逃避、促進(jìn)新生血管形成等[3]。OPN的一級(jí)結(jié)構(gòu)中的RGD序列是一種粘附基序，在OPN與其主要受體avl33，CD44的結(jié)合、增強(qiáng)細(xì)胞與基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞的粘附、介導(dǎo)細(xì)胞的移行中起重要作用[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)OPN與腫瘤細(xì)胞生長、增殖和侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]。Brown等發(fā)現(xiàn)OPN主要位于腫瘤浸潤的前沿，OPN在細(xì)胞的表達(dá)部位隨腫瘤惡性化發(fā)展的改變，分化差的結(jié)直腸癌OPN主要集中于與細(xì)胞外基質(zhì)交界的腫瘤細(xì)胞的基底面，分化好的結(jié)直腸癌OPN主要位于腫瘤細(xì)胞的頂部表面，與正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞的定位相似，這提示OPN在腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤過程中具有重要作用。丁凌等[6]研究表明，在肝臟中存在OPN的受體整合素和CD44v6的陽性表達(dá)，使得分泌OPN的結(jié)直腸癌細(xì)胞得以在肝臟中滯留。在轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，涉及了一系列酶-酶，配體-受體，蛋白-蛋白之間的相互作用,OPN與其受體之間相互作用及OPN對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞同質(zhì)異質(zhì)粘附的影響，可能是結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的啟動(dòng)和發(fā)展過程中可能都起著極其重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，OPN陽性表達(dá)區(qū)域主要位于細(xì)胞質(zhì)，周圍基質(zhì)中少數(shù)炎癥細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中也有表達(dá)。OPN的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤的浸潤深度、腫瘤直徑無關(guān)，與Dukes分期及有無肝轉(zhuǎn)移有關(guān)。OPN在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移組、Dukes C+D組呈高表達(dá)，與相應(yīng)對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，OPN在正常腸黏膜組織、結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)率有顯著差異，提示OPN可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生、浸潤和結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移方面扮演重要角色。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一大類具有降解細(xì)胞外基質(zhì)成分功能的蛋白酶，從而促進(jìn)腫瘤浸潤，導(dǎo)致不良預(yù)后。最新的研究表明MMPs在腫瘤進(jìn)展中的作用還包括參與增殖、凋亡和細(xì)胞分化。MMPS可以與很廣泛的非基質(zhì)蛋白相互作用，包括生長因子、生長因子受體、細(xì)胞黏附分子、趨化因子、調(diào)節(jié)凋亡蛋白、其它蛋白酶和凝血因子[7-9]。一些MMPs可以被一些關(guān)鍵的癌基因和抑癌基因在轉(zhuǎn)錄水平激活，參與結(jié)直腸癌的癌變。很多研究表明MMPS表達(dá)的增強(qiáng)或活性增加與結(jié)直腸癌預(yù)后有關(guān)[10]。MMP-9的主要底物均為IV/V型膠原。Ⅳ型膠原為基底膜中結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì)維持基底膜的完整性至關(guān)重要。由于Ⅳ型膠原獨(dú)特的螺旋結(jié)構(gòu)，因此大部分蛋白酶對(duì)其無降解作用，但MMP-9可以降解Ⅳ型膠原和層粘連蛋白等成分，破壞基底膜的完整性，這是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的先決條件。本研究提示，MMP-9陽性顆粒主要位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，基質(zhì)內(nèi)少數(shù)血管內(nèi)皮細(xì)胞染色陽性，細(xì)胞外基質(zhì)中的陽性表達(dá)，說明腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的相互協(xié)同作用，形成腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的微環(huán)境。此外，MMP-9陽性表達(dá)的組織基底膜不完整，甚至部分基底膜有缺損或斷裂。MMP-9的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤的浸潤深度、腫瘤直徑無關(guān)，與Dukes分期、分化程度及有無肝轉(zhuǎn)移有關(guān)。MMP-9在正常腸黏膜組織、結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)率的顯著差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移組和無肝轉(zhuǎn)移組中基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)情況相互比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示MMP-9可能參與結(jié)腸直腸癌的發(fā)生、發(fā)展結(jié)腸直腸癌侵襲肝轉(zhuǎn)移過程有關(guān)，其可能成為結(jié)腸直腸癌預(yù)后判斷的參考指標(biāo)。

MMP-9的表達(dá)受體內(nèi)外許多調(diào)節(jié)因子的影響，整合蛋白就可以加強(qiáng)它的功能。整合蛋白通過RGD位點(diǎn)與已經(jīng)被基質(zhì)金屬蛋白酶水解的膠原相結(jié)合，使腫瘤細(xì)胞ανβ3受體表達(dá)增強(qiáng)，從而提高腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移的能力。研究已經(jīng)證實(shí)OPN通過與整合素ανβ3受體的結(jié)合，可以提高M(jìn)MP-9的表達(dá)和激活、細(xì)胞的遷移、基質(zhì)細(xì)胞的浸潤，從而導(dǎo)致腫瘤的形成。Rangaswami應(yīng)用B16F10細(xì)胞株研究發(fā)現(xiàn)，OPN可激活NIK并增強(qiáng)其調(diào)控uPA分泌和uPA依賴性蛋白pro-MMP-9的活化，故OPN可能在腫瘤早期侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要的調(diào)控作用[11]。此外，OPN和MMP-9也可能通過旁分泌效應(yīng)改變周圍基質(zhì)的微環(huán)境，如促進(jìn)腫瘤血管形成等，以利于腫瘤向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，OPN和MMP-9的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.405，P=0.002，P＜O.05)，OPN表達(dá)增加可能使得MMP-9表達(dá)上調(diào)。因此推測，OPN和MMP-9在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能具有協(xié)同作用。

綜上所述，本研究驗(yàn)證了OPN和MMP-9在結(jié)直腸癌及其肝轉(zhuǎn)移中的高表達(dá)，提示OPN和MMP-9與結(jié)直腸癌的發(fā)生、浸潤、肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，同時(shí)檢測二者的表達(dá)情況有可能為結(jié)直腸癌的早期診斷及判斷預(yù)后提供重要依據(jù)。

[1]Obrand DI，Gordon PH.Incidence and patterns of recurrenee following curative resection for colorectal carcinoma[J].Dis Colon Rectum，1997，40(1)：15-24.

[2]Fong Y,Cohen AM,Fortner JG,et al.Liver resection for colorectal metastases[J].J Clin Oneol,1997,15(3):938-946.

[3]Wai PY, Kuo PC.Osteopontin:regulation in tumor metastasis[J].Cancer Metastasis Rev,2008,27(1):103-118.

[4]Gilbert M，Shaw WJ，Long JR，et al.Chimeric Pepfides of Statherin and Osteoponfin That Bind Hydroxyapatite and Mediate Cell Adhesion[J].Biol Chem，2000，275(21)：16213-16218.

[5]Wai PY，Kuo PC.The role of Osteopontin in tumor metastasis[J].Surg Res，2004，121(2)：228-241.

[6]丁凌，鄭樹，曹江.結(jié)直腸癌中骨橋蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)及其與肝轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2002，82(14)：970-973.

[7]Powell WC，F(xiàn)ingleton B，Wilson CL，Boothby M，Matrisian LM.The metalloproteinase matrilysin proteolytically generates active soluble Fas ligand and potentiates epithelial cell apoptosis[J].Curr Biol,1999；9：1441-1447.

[8]Vargo Gogola T，Crawford HC，Gingleton B，Matrisian LM.Identification of novel matrix metalloproteinase一7(matrilysin)cleavage sites in routine and human Fas ligand[J].Arch Bioehem Biophys, 2002,408：155-161.

[9]Lo YL,Leoh TH,Xu LQ,et al.Short-segment nerve conduction studies in the localization of ulnar neuropathy of the elbow:use of flexor carpiulnaris recording[J].Muscle Nerve,2005,31(5):633-636.

[10]EgebladM,Werb Z.New functions for the matrix metalloproteinase in cancer progression[J].Nature Rev Cancer,2002,2(3):164-174.

[11]Rangaswami H,Bulbule A,Kundu GC.Nuclear factor inducing kinase plays crucial role in osteopontin induced MAPK/IKK dependent nuclear factor kappa B-mediated promatrix metalloproteinase-9 activation[J].J Boil Chem,2004,279(37):38921-38935.