張 敏, 李瑞霞, 伊紀(jì)峰, 沈頌東, 胡傳明, 應(yīng)上云, 湯 俊, 張 濤,許 璞

（1. 蘇州大學(xué) 醫(yī)學(xué)部 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院, 江蘇 蘇州 215123; 2. 常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院,江蘇 常熟 215500; 3. 江蘇省海洋與水產(chǎn)研究所, 江蘇 南通 226007）

4種經(jīng)濟(jì)海藻脂肪酸組成分析

張 敏1, 李瑞霞1, 伊紀(jì)峰2, 沈頌東1, 胡傳明3, 應(yīng)上云2, 湯 俊2, 張 濤2,許 璞2

（1. 蘇州大學(xué) 醫(yī)學(xué)部 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院, 江蘇 蘇州 215123; 2. 常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院,江蘇 常熟 215500; 3. 江蘇省海洋與水產(chǎn)研究所, 江蘇 南通 226007）

采用改進(jìn)的 Bligh-Dyer法提取脂溶性成分, 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）進(jìn)行分離和鑒定,C19:0內(nèi)標(biāo)確定總脂及各組分含量, 研究了鼠尾藻（Sargassum thunbergii）、滸苔（Enteromorpha prolifera）、龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）和紅毛菜（Bangiasp.）4種經(jīng)濟(jì)海藻的脂肪酸組成及含量。結(jié)果表明, 4種海藻都檢測出C14-C22脂肪酸, 總脂含量在12～19 mg/g之間, 不飽和脂肪酸為主要組成成分,含量均超過60%。不飽和脂肪酸中以多不飽和脂肪酸（PUFAs）為主, 富含n-3和n-6系列PUFAs, n-6與n-3系列PUFAs之比均低于2。比較4種海藻脂肪酸組成特點(diǎn)表明, 鼠尾藻以C16、C18和C20為主要組成成分, 具褐藻類脂肪酸組成特征; 滸苔以C16和C18為主要組成成分, 具綠藻類脂肪酸組成特征;龍須菜和紅毛菜以C16和C20類脂肪酸為主, 具典型紅藻類脂肪酸組成特征, 同時(shí)二者又有不同之處,分別顯示真紅藻與原始紅藻脂肪酸組成的特點(diǎn)。

鼠尾藻（Sargassum thunbergii）; 滸苔（Enteromorpha prolifera）; 龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）; 紅毛菜（Bangiasp.）; 脂肪酸; 氣相色譜質(zhì)譜法

海藻是重要的海洋生物資源, 種類豐富, 在我國已記錄800種左右, 其中有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的有100多種,主要是褐藻、紅藻和綠藻等大型種類[1-2]。鼠尾藻（Sargassum thunbergii）隸屬褐藻門（Phaeophyta）, 在我國北起遼東半島南至雷州半島都有分布, 是我國海洋野生植物中極為豐富的大型經(jīng)濟(jì)海藻[3]。滸苔（Enteromorpha prolifera）屬綠藻門（Chlorophyta）, 廣泛分布于我國南北海區(qū), 是資源豐富的綠藻資源[4]。龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）和紅毛菜（Bangiasp.）同屬紅藻門（Rhodophyta）, 分屬真紅藻亞綱（Florideophycidae）和紅毛菜亞綱（Bangioideae）。龍須菜產(chǎn)于我國北方沿海, 以山東沿海分布較多[6]; 紅毛菜是海洋原始藻類的代表, 在我國南北方沿海都有分布, 以東南沿海為多[5]。龍須菜和紅毛菜都是重要的經(jīng)濟(jì)栽培海藻。

脂肪酸是一端含有一個(gè)羧基的長脂肪族碳?xì)滏溣袡C(jī)物, 依據(jù)飽和度的不同, 分為飽和脂肪酸（SFA）、單不飽和脂肪酸（MUFA）和多不飽和脂肪酸（PUFA）[7]。海藻脂質(zhì)含量較低, 一般為0.1%～1.0%,但不飽和脂肪酸（UFA）含量較高, 尤其富含n-3和n-6系列PUFAs, 是PUFAs的重要來源[8-9]。丹麥科學(xué)家Dyerberg[10]1978年報(bào)道, n-3系列PUFAs具有抗動脈粥樣硬化、血栓、高血脂和高血壓以及消除炎癥等重要生理活性, 引起人們對不飽和脂肪酸研究的廣泛關(guān)注[7]。Kaneniwa等[11]對海藻多不飽和脂肪酸組成的研究, 發(fā)現(xiàn)其具豐富的 n-3和 n-6系列 PUFAs,n-6/n-3PUFAs比率低。Jamieson等[12]、Khotimchenko等[13-14]分別報(bào)道了不同種屬常見海藻的脂肪酸組成特點(diǎn), 認(rèn)為脂肪酸組成具有種屬特征, 紅藻主要含C16和C20類脂肪酸, 綠藻主要是C16和C18類脂肪酸,褐藻主要有C16、C18和C20類脂肪酸。蔡春等[15]、李憲催等[16]在對我國海藻脂肪酸分析研究中, 也報(bào)道了多種海藻的脂肪酸組成具有種屬特異性的特點(diǎn)[15-16]。

本研究以大型海藻中的重要經(jīng)濟(jì)物種為對象,分析不同種屬海藻脂肪酸組成特征以及差異性, 重點(diǎn)比較n-3和n-6系列PUFAs在經(jīng)濟(jì)海藻中的組成特點(diǎn), 以期為了解海藻資源特點(diǎn)及其進(jìn)一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)性資料。

1 材料與方法

1.1 材料及前處理

測試材料采集于2010年春季, 龍須菜和鼠尾藻采自青島海區(qū)自然生長藻體, 紅毛菜和滸苔在黃海南部海區(qū)的紫菜栽培伐架上采摘獲取。上述材料采用低溫法帶回實(shí)驗(yàn)室, 潔凈海水清洗, 剔除雜藻雜物, 蒸餾水漂洗 3次, 低溫風(fēng)干, 研磨, 100目過篩,?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 脂肪酸提取

采用改進(jìn)的 Bligh-Dyer（m-BD）法[17]進(jìn)行脂肪酸提取。0.2 g藻粉, 加入10 mL混合比例為1:2:0.8的氯仿、甲醇和蒸餾水溶劑, 勻漿, 加入C19:0內(nèi)標(biāo)40 μg, 40 KHz超聲處理5 min, 5 000 g離心5 min, 收集上清。沉淀部分重復(fù)上述操作, 共提取3次, 合并上清, 加入等體積混合比1:1的氯仿和蒸餾水溶液, 使其終濃度為氯仿:甲醇:蒸餾水= 1:1:0.9。加入 1 mL 5%氯化鈉混勻, 靜置。上層為水相, 含鹽類和水溶性物質(zhì), 下層為氯仿層, 氯仿層轉(zhuǎn)至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀, 旋轉(zhuǎn)干燥, 獲得總脂肪酸。

在上述脂肪酸測樣中, 加入 1 mL 1.5%（W/V）NaOH/CH3OH溶液, 55℃水浴保溫15 min, 再加入2 mL 5%（V/V）HCl/CH3OH溶液, 繼續(xù)55℃水浴保溫20 min。取2 mL正己烷, 加入上述反應(yīng)體系混勻, 靜置分層, 吸出上層正己烷相, 再向下層水相中加入 2 mL正己烷, 重復(fù)上述步驟, 合并 3次吸出液, 于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)蒸干, 1 mL正己烷定容, 待分析。

1.3 GC-MS分析條件

儀器: QP2010氣相色譜-質(zhì)譜分析儀, AOC-20i自動進(jìn)樣器（日本 SHIMADZU 公司）, 30 m×0.25 mm×0.25 um RTX-Wax色譜柱（美國SUPELCO公司）。

GC條件: 進(jìn)樣口溫度220℃, 檢測器溫度250℃,載氣為高純氦氣（99.999%）, 柱流速 1.0 mL/min, 進(jìn)樣時(shí)間1 min, 溶劑延遲3 min, 柱起始溫度60℃, 保持 2 min, 以 15℃/min升溫至 120℃, 然后以2.5℃/min升溫至220℃, 保持15 min。采用分流進(jìn)樣模式, 分流比50:1, 進(jìn)樣量1 μL。

MS條件: 電子轟擊（EI）離子源, 電子能量 70 eV,離子源溫度 230℃, 接口溫度 220℃, 選取全程離子碎片掃描（SCAN）模式, 質(zhì)量掃描范圍為 45～450 m/z。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置 3個(gè)重復(fù), 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）。脂肪酸含量的計(jì)算先采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算實(shí)際含量, 然后換算成百分含量。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件Origin7.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)誤差分析。

2 結(jié)果

2.1 總離子流圖譜

鼠尾藻、滸苔、龍須菜和紅毛菜的脂肪酸成分總離子流圖（圖1、2、3、4）顯示, 4種經(jīng)濟(jì)海藻含有C14-C22的脂肪酸, 其脂肪酸組成相似。各脂肪酸組分按出峰順序依次為C14:0、C15:0、C16:0、C16:1、C17:0、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3、C20:0、C20:1、C20:2、C20:3、C20:4、C20:5、C22:0、C22:1和 C22:5,所有組分在保留時(shí)間55.0 min內(nèi)均達(dá)到基線分離。

內(nèi)標(biāo)C19:0出峰時(shí)間在39.5 min。

圖1 鼠尾藻脂肪酸甲酯總離子流色譜圖Fig. 1 TIC of fatty acid methyl esters from S. thunbergii

圖2 滸苔脂肪酸甲酯總離子流色譜圖Fig. 2 TIC of fatty acid methyl esters from E. prolifera

圖3 龍須菜脂肪酸甲酯總離子流色譜圖Fig. 3 TIC of fatty acid methyl esters from G. lemaneiformis

2.2 脂肪酸組分

根據(jù)氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖中各組分的離子碎片質(zhì)量譜圖, 通過NIST05及NIST05s譜圖庫檢索,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)譜圖確認(rèn)其成分, 同時(shí)采用內(nèi)標(biāo)法測得總脂及各組分含量。定性、定量結(jié)果如表1。

圖4 紅毛菜脂肪酸甲酯總離子流色譜圖Fig. 4 TIC of fatty acid methyl esters from Bangia sp.

表1 4種海藻脂肪酸組成及相對含量Tab. 1 The compositions and relative contents of fatty acids in the four algae

2.3 總脂含量

4種海藻總脂含量如圖5所示。鼠尾藻中鑒定出21種脂肪酸, 總脂含量 13.54 mg/g; 滸苔鑒定出 19種脂肪酸, 總脂在 4種海藻中最低, 為 12.64 mg/g;龍須菜和紅毛菜均鑒定出18種脂肪酸, 二者總脂含量相對較高, 分別為16.99 mg/g和18.28 mg/g。4種海藻總脂含量的范圍在12～19 mg/g之間。

圖5 4種海藻總脂含量Fig. 5 The total lipid contents in the four algae

2.4 SFAs、UFAs含量及組成

4種海藻SFAs都以 C16:0為主, 而UFAs組成有明顯差異。鼠尾藻 UFAs主要是 C18:1（n-9）、C18:2（n-6）、C18:3（n-3）、C20:4及 C20:5; 滸苔 UFAs組分主要為 C18:1（n-7）、C18:2（n-6）及 C18:3（n-3）; 龍須菜UFAs以C20:4和C20:5為主, 紅毛菜C20:5含量顯著, 高達(dá) 42.89%。4種海藻 SFAs范圍在31.80%～39.95%之間, UFAs在 60.05%～68.20%之間, SFAs與UFAs含量之比在1:2左右（圖6）。

圖6 4種海藻SFAs與UFAs相對含量Fig. 6 The relative contents of SFAs and UFAs in the four algae

2.5 n-3和n-6系列PUFAs含量及組成

4種海藻n-3和n-6系列PUFAs組成如圖7所示。鼠尾藻PUFAs占總脂的44.26%, 其中n-3系列含量占總脂 20.45%, n-6系列占 23.06%, n-6/n-3系列PUFAs之比為1.13; 滸苔的PUFAs占總脂的37.86%,n-3系列含量占總脂 27.54%, n-6系列占 8.79%,n-6/n-3系列PUFAs比值為0.32; 龍須菜中PUFAs占總脂含量的45.32%, n-3系列含量為總脂的26.33%,n-6系列為18.75%, n-6/n-3系列PUFAs比例為0.71;紅毛菜PUFAs含量相對較高, 占總脂含量的54.51%,n-3系列 PUFAs相對含量為 43.09%, n-6系列為11.41%, n-6/n-3系列PUFAs之比為0.27。

圖7 4種海藻n-6及n-3系列PUFAs相對含量Fig. 7 The relative contents of n-6 and n-3 PUFAs in the four algae

3 討論

3.1 4種海藻脂肪酸組成特征

海藻脂肪酸組成具有種屬特異性[12-16]。紅藻主要含十六碳SFAs和二十碳PUFAs, 幾乎不含二十二碳 PUFAs[18]。綠藻以十六碳 SFAs和十八碳 UFAs為主, 含有微量的二十碳 PUFAs, 具有較高含量 α-亞麻酸是綠藻脂肪酸組成的突出特征[19]。褐藻所含脂肪酸種類較紅藻和綠藻豐富, 以十六碳 SFAs、十八碳UFAs和二十碳PUFAs為其脂肪酸主要組分[14]。本文測試結(jié)果顯示, 鼠尾藻所含脂肪酸種類較滸苔、龍須菜和紅毛菜豐富, 其中 C16:0、C18:1（n-9）、C18:2（n-6）、C18:3（n-3）、C20:4和C20:5是主要成分,占總脂肪酸的一半左右; 滸苔以C16:0、C18:1（n-7）、C18:2（n-6）及 C18:3（n-3）為主, 含有微量的二十碳PUFAs（C20:4和 C20:5）, 具有較高含量 α-亞麻酸（C18:3 n-3）; 龍須菜和紅毛菜以 C16:0、C20:4和C20:5為主, 幾乎不含二十二碳PUFAs。4種海藻脂肪酸組成特點(diǎn)與前人對海藻脂肪酸的研究報(bào)道相似,鼠尾藻具褐藻類脂肪酸組成特征, 滸苔表現(xiàn)綠藻的脂肪酸組成特征, 龍須菜和紅毛菜顯示典型的紅藻脂肪酸組成特征。

一般認(rèn)為, 紅藻脂肪酸組成是有相對高的十六碳 SFAs和二十碳 PUFAs（C20:4和 C20:5）[18]。本研究結(jié)果表明, 紅毛菜與龍須菜在二十碳 PUFAs組成上有明顯差異, 龍須菜C20:4和C20:5相對含量都較高, 而紅毛菜以 C20:5為主要組分, 僅含微量的C20:4。馬家海等（2002）[22]報(bào)道紅毛菜脂肪酸 C20:5含量高達(dá)51.74%, Kayama等[20]、陳人弼等[21]報(bào)道條斑紫菜和壇紫菜的二十碳PUFAs也都以C20:5為主,其含量超過50%, 僅含微量C20:4。而仙菜目、隱絲藻目、杉藻目和海索面目等真紅藻則富含 C20:4和C20:5[15-16]。根據(jù)已有研究結(jié)果可以認(rèn)為, 二十碳PUFAs中C20:4和C20:5的相對含量水平是真紅藻和原始紅藻脂肪酸組成的區(qū)分特征。

3.2 4種海藻n-3與n-6系列PUFAs組成特點(diǎn)

n-3與n-6系列多不飽和脂肪酸含量及其比值是衡量脂肪酸價(jià)值的重要指標(biāo), 特別是n-3系列PUFAs在人體的營養(yǎng)、發(fā)育和健康等方面起著重要作用[8-9]。紫菜、滸苔、馬尾藻和江蘺等經(jīng)濟(jì)海藻的脂肪酸組成中, 都富含n-3與n-6系列PUFAs, 尤其是n-3系列的EPA和DHA, 這些海藻中n-6與n-3系列PUFAs相對含量的比率均低于3[21-26]。紫菜屬和紅毛菜屬海藻含有豐富的n-3系列PUFAs, EPA占到總脂肪酸的50%左右[20-22]。本研究中滸苔、江蘺和紅毛菜含有較高 n-3系列 PUFAs, 其中又以紅毛菜的 n-3系列PUFAs含量顯著, 鼠尾藻雖含有較高的 n-6系列PUFAs, 但4種經(jīng)濟(jì)海藻n-6與n-3系列PUFAs比率均低于2。人類膳食結(jié)構(gòu)中n-3 PUFAs相對缺乏[27],聯(lián)合國衛(wèi)生組織WHO[28]推薦飲食中n-6/n-3攝入比例應(yīng)低于 4～5。本文研究結(jié)果表明, 經(jīng)濟(jì)海藻富含n-3系列 PUFAs, 并且 n-6/n-3比例符合健康膳食的要求, 具有良好的開發(fā)利用前景。

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Received: Dec.,17,2010

Key words:Sargassum thunbergii; Enteromorpha prolifera; Gracilaria lemaneiformis; Bangia sp.; fatty acid; GC-MS

Abstract:The fat-soluble components were extracted using a modified Bligh-Dyer method, which were further separated and identified by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）, with C19:0 as internal control. The fatty acid composition of four economic algaes includingSargassum thunbergii,Enteromorpha prolifera,Gracilaria lemaneiformisandBangiasp. were determined. The C14-C22 fatty acids were detectable in all of the four algae with total lipid contents varying between 12-19 mg/g. The unsaturated fatty acids were the main components among the fatty acids, which accounted for more than 60%. The polyunsaturated fatty acids （PUFAs）, especially the n-6 and n-3 PUFAs, were the main components among the unsaturated fatty acids. The content ratios of n-6/n-3 PUFAs were all less than 2. The comparison of fatty acid composition showed that fatty acid designated C16, C18 and C20 were the major composition inS. thunbergii, exhibiting typical fatty acid composition characteristic of brown algae. C16 and C18 were the major fatty acid composition inE. prolifera, the typical characteristic of green algae. BothG. lemaneiformisandBangiasp. mainly contained C16 and C20, which was the typical characteristic of red algae. Meanwhile,G. lemaneiformisandBangiasp. exhibited typical composition characteristic of Florideophycidae and Bangioideae, respectively.

（本文編輯:康亦兼）

Analysis of the fatty acid composition of four economic seaweeds

ZHANG Min1, LI Rui-xia1, YI Ji-feng2, SHEN Song-dong1, HU Chuan-ming3,YING Shang-yun2, TANG Jun2, ZHANG Tao2, XU Pu2

（1. School of Medicine and Life Sciences, Medical College of Suzhou University, Suzhou 215123, China; 2. Department of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China; 3. Marine Fisheries Institute of Jiangsu Province, Nantong 226007, China）

Q547

A

1000-3096（2012）04-0007-06

2010-12-17;

2011-06-10

國家863計(jì)劃項(xiàng)目（2006AA10A413）資助

張敏（1983-）, 女, 山東臨沂人, 碩士研究生, 研究方向?yàn)榧?xì)胞生物學(xué), 電話: 15020351146, E-mail: zhangmin840818@163.com