張 曼，郜小龍，張 麗，祝偉霞

(1.河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007； 2.河南出入境檢驗檢疫局，鄭州 450003)

磷酸香草醛法測定不同培養(yǎng)條件下四尾柵藻(Scenedesmusobliquus)總脂含量

張 曼1，郜小龍1，張 麗2，祝偉霞2

(1.河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007； 2.河南出入境檢驗檢疫局，鄭州 450003)

驗證了磷酸香草醛反應(yīng)在不同氮(0.2、2、20、40 mg/L)、磷(0.1、1、10、20 mg/L)質(zhì)量濃度培養(yǎng)條件下測定四尾柵藻總脂含量的可靠性。結(jié)果表明：不同氮、磷質(zhì)量濃度條件下柵藻總脂含量和磷酸香草醛測定吸光度之間均呈顯著的線性回歸關(guān)系(不同氮質(zhì)量濃度條件：R=0.997，P=0.003；不同磷質(zhì)量濃度條件：R=0.994，P=0.006)，在不同氮、磷質(zhì)量濃度培養(yǎng)條件下該方法的測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以用于柵藻的總脂含量測定。磷酸香草醛反應(yīng)的顯色強度可能與脂肪酸的飽和度有關(guān)，為保障該方法測定總脂含量的準(zhǔn)確性，用該方法估算總脂含量須在氮、磷質(zhì)量濃度變化范圍內(nèi)進行預(yù)先驗證。

微藻；總脂含量；磷酸香草醛反應(yīng)；測定方法

受能源危機的影響，微藻在生產(chǎn)生物能源方面的潛力備受關(guān)注[1]。藻細胞能通過光合作用將太陽能轉(zhuǎn)化為生物能，再通過不同的加工過程生產(chǎn)各種生物燃料。與其他油料作物相比，微藻具有生長速度快、產(chǎn)能高、油脂含量高、抗極端條件能力強等特點[2]。微藻生產(chǎn)的油脂具有產(chǎn)量高、品性好、易于調(diào)控和改良等多重優(yōu)勢，目前對于微藻油脂的研究多集中在提高微藻含油量的方法上[3]。但現(xiàn)今微藻生物燃料生產(chǎn)仍面臨多重技術(shù)困難。其中，對微藻粗脂肪含量的傳統(tǒng)測定方法冗繁復(fù)雜，是微藻能源開發(fā)過程中亟待解決的問題之一[4]。特別是在微藻培養(yǎng)過程的連續(xù)監(jiān)測中，總脂含量測定往往所需藻液體積大，操作復(fù)雜費時，不利于培養(yǎng)者及時掌握微藻實時脂肪積累情況。

生物體與磷酸香草醛試劑反應(yīng)，可以產(chǎn)生一種紅色物質(zhì)，這是磷酸香草醛反應(yīng)可以用于測定總脂含量的基礎(chǔ)。推測認為試劑中的磷酸與香草醛的羥基作用后產(chǎn)生芳香族磷酸酯，并且改變了香草醛分子中的電子分配，使醛基變成酯基；另一方面，不飽和脂肪酸與硫酸作用可以水解生成碳鎓離子。磷酸酯與碳鎓離子發(fā)生反應(yīng)，最終生成紅色醌化物，在530 nm處存在最大吸收峰，根據(jù)顏色深淺(吸光度)即可定性分析總脂含量的高低。但是需要指出，磷酸香草醛反應(yīng)的顯色強度與脂肪酸的飽和程度有關(guān)，也就是說只有在微藻不飽和脂肪酸占總脂含量比例(即脂肪酸飽和度)變化不大的前提下，用磷酸香草醛反應(yīng)估算總脂含量才是可靠的。李仁民等[5]利用磷酸香草醛反應(yīng)估算酵母菌的油脂含量。羅瑋等[6]也利用磷酸香草醛反應(yīng)成功估算了豐富柵藻、小球藻、小環(huán)藻等多種微藻的油脂含量。

然而，微藻的脂肪酸飽和度在不同氮、磷質(zhì)量濃度培養(yǎng)條件下可能會受到影響[7-8]。研究[9-10]顯示，微藻在缺氮狀態(tài)下，自身的生長(即蛋白質(zhì)和核酸合成)受到限制，但其碳同化的過程一直進行，從而進入脂類代謝，提高了甘油三酯含量。有研究[11-12]進一步指出，微藻從氮源正常培養(yǎng)到氮源受限培養(yǎng)，油脂組成也會由富含游離脂肪酸變?yōu)楦视腿ァ旁鍖偈浅Ｒ姷牡G藻，生長快速，能大量合成油脂，已成為開辟生物燃料的首選原料。Chen等[13]研究表明通過分批式培養(yǎng)28 d，柵藻的平均生物量產(chǎn)率可達0.105 g/(L·d)(干重)，最高油脂含量可達干重的35%。本文利用四尾柵藻(Scenedesmusobliquus)開展研究，擬通過磷酸香草醛法建立一種快速、高效且靈敏的分析微藻總脂含量的測定方法，用以替代有機溶劑提取法煩瑣過程，為實現(xiàn)微藻總脂含量的測定以及用于新能源生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗藻種采用已在水體中成功分離生長迅速的四尾柵藻活性藻株。以HGZ作為微藻的培養(yǎng)基[14]，進行種子液制備。

HGZ培養(yǎng)基配方：NaNO30.3 g/L，KNO30.051 g/L，K2HPO40.049 g/L，MgSO4·7H2O 0.075 g/L，Na2CO30.02 g/L，Ca(NO3)2·4H2O 0.059 g/L，NH4Cl-EDTA 0.0391 g/L，HBO32.86 mg/L，MnCl2·4H2O 1.81 mg/L，ZnSO4·7H2O 0.222 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.391 mg/L，CuSO4·5H2O 0.079 mg/L，F(xiàn)e-EDTA 0.932 mg/L。

1.2 實驗方法

1.2.1 四尾柵藻的培養(yǎng)

使用調(diào)整氮(NaNO3)、磷(K2HPO4)后的HGZ培養(yǎng)基配方對四尾柵藻進行為期14 d的培養(yǎng)。實驗分別設(shè)置4個磷質(zhì)量濃度處理組(1～4)和4個氮質(zhì)量濃度處理組(5～8)，詳見表1，每處理組設(shè)置3個平行。

表1 處理組的氮、磷質(zhì)量濃度

實驗開始前，取處于穩(wěn)定生長期的柵藻母液(濃度>109個/mL)離心收集藻細胞，用不含氮、磷源的培養(yǎng)基重新懸浮，待接種。將氮、磷質(zhì)量濃度配制好的液體培養(yǎng)基置于1 L錐形瓶中進行2 h的高壓滅菌，冷卻后按照1.2×106個/mL的初始濃度進行接種，置于培養(yǎng)箱中進行為期14 d的培養(yǎng)，光照條件為60 μmol/(m2·s)，培養(yǎng)溫度為25℃。收集培養(yǎng)結(jié)束的藻液，一部分用磷酸香草醛法測定總脂含量，其余藻液測定體積后置于50 mL離心管中，10 000 r/min 離心3 min后棄上清，并用蒸餾水洗滌2次，將藻泥冷凍干燥2 h，干燥后的藻粉用標(biāo)準(zhǔn)方法測定微藻脂肪含量。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)方法測定柵藻總脂含量

取100 mg藻粉加入2 mL 10%二甲亞砜-甲醇溶液，分別于50℃抽提30 min、冰浴抽提30 min后，離心收集上清液于預(yù)先烘干的玻璃小瓶中，藻渣加入4 mL乙醚-正己烷(體積比1∶1)，冰浴抽提1 h，離心收集上清液至同一玻璃小瓶中，重復(fù)上述過程直到藻渣變白。在合并的抽提液中加入純水，使二甲亞砜-甲醇、水、乙醚、正己烷的比例為1∶1∶1∶1(體積比)，振蕩分相，移取有機相至另一玻璃小瓶中，在通風(fēng)櫥中用氮氣吹至較小體積，將濃縮液轉(zhuǎn)移至預(yù)先稱重的1.5 mL塑料離心管中，用氮氣吹干至恒重，即得總脂含量[15]。

1.2.3 磷酸香草醛法測定柵藻總脂含量

磷酸香草醛試劑：0.12 g香草醛溶解于20 mL蒸餾水中，用85%的磷酸定容至100 mL。

測定方法：將培養(yǎng)濃度大于106個/mL的藻液取出，準(zhǔn)確量取體積1 mL，于10 000 r/min離心5 min，用蒸餾水重新定容至1 mL(以蒸餾水為參照)，加入10 mL具塞比色管中，加入2 mL 18 mol/L H2SO4，于沸水浴中孵化10 min，常溫水浴孵化10 min，加5 mL磷酸香草醛試劑，37℃保溫15 min，再常溫水浴10 min，于530 nm處測定吸光度。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

取平行樣品的均值作相關(guān)分析的計算。用Pearson相關(guān)分析被測指標(biāo)之間的相關(guān)系數(shù)。設(shè)定P<0.05具有顯著差異。數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用統(tǒng)計分析軟件SPSS 16.0進行線性回歸分析。用Excel軟件進行數(shù)據(jù)錄入和基本作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷酸香草醛測定吸光度與標(biāo)準(zhǔn)法測定總脂含量(見表2、圖1)

表2 磷酸香草醛測定吸光度與標(biāo)準(zhǔn)法測定總脂含量

圖1磷酸香草醛法測定吸光度與末期柵藻濃度的相關(guān)性

從表2、圖1可以看出，在收獲末期，磷酸香草醛法測定的吸光度(y)和末期柵藻濃度(x)之間存在顯著的線性相關(guān)關(guān)系(y=0.006 7x-0.000 9，R=0.963，P<0.001)，表明在培養(yǎng)條件范圍內(nèi)，磷酸香草醛法測定的脂肪酸濃度和末期柵藻濃度呈正比。標(biāo)準(zhǔn)方法測定總脂含量(y)與末期柵藻濃度(x)也呈顯著的線性相關(guān)關(guān)系(y=2.148 1x-0.244 2，R=0.934，P=0.001)，表明總脂含量和末期柵藻濃度呈正比。

2.2 磷酸香草醛法測定不同氮、磷質(zhì)量濃度條件下柵藻油脂含量

從表2可以看出，隨著氮、磷質(zhì)量濃度增高，總脂含量均隨之增加。在不同磷質(zhì)量濃度條件下，磷酸香草醛法測定的吸光度(x)與標(biāo)準(zhǔn)方法測定總脂含量(y)之間存在顯著的線性相關(guān)關(guān)系(y=326.2x+0.056，R=0.994，P=0.006)。在不同氮質(zhì)量濃度條件下，磷酸香草醛法測定的吸光度(x)與標(biāo)準(zhǔn)方法測定總脂含量(y)之間也存在顯著的線性相關(guān)關(guān)系(y=314.2x-0.104，R=0.997，P=0.003)。綜合不同氮、磷質(zhì)量濃度培養(yǎng)條件來看，磷酸香草醛法測定的吸光度(x)和標(biāo)準(zhǔn)方法測定總脂含量(y)之間也存在顯著的線性相關(guān)關(guān)系(y=326.23x-0.182 1，R=0.994，P=0.000)，表明磷酸香草醛法用于測定柵藻總脂含量具有可行性。

3 結(jié) 論

本文利用磷酸香草醛反應(yīng)測定了四尾柵藻總脂含量，結(jié)果表明在不同磷、氮質(zhì)量濃度條件下該方法的測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以用于在該培養(yǎng)條件下柵藻的總脂含量測定。

與磷質(zhì)量濃度培養(yǎng)條件變化相比，在不同氮質(zhì)量濃度條件下柵藻總脂含量和磷酸香草醛測定吸光度之間線性回歸的斜率相近，綜合不同氮、磷質(zhì)量濃度培養(yǎng)條件來看，柵藻總脂含量和磷酸香草醛法測定吸光度之間線性關(guān)系顯著，這表明在不同氮、磷質(zhì)量濃度條件下，利用磷酸香草醛反應(yīng)的顯色強度測定總脂含量是準(zhǔn)確可靠的。本研究中，根據(jù)磷酸香草醛反應(yīng)的原理，只要柵藻中不飽和脂肪酸占總脂含量的比例不發(fā)生變化或變化不大，利用該反應(yīng)測定藻類總脂含量就是可行的。推測本實驗中，柵藻在不同氮、磷質(zhì)量濃度條件下，油脂中不飽和脂肪酸含量變化不大，這是利用磷酸香草醛反應(yīng)成功測定總脂含量的主要原因。利用磷酸香草醛反應(yīng)進行藻類總脂測定的過程中不需要復(fù)雜的實驗儀器，測定方法快速準(zhǔn)確，特別適用于大規(guī)模分析及連續(xù)監(jiān)測。但磷酸香草醛反應(yīng)的顯色強度與脂肪酸的飽和度有關(guān)，用磷酸香草醛反應(yīng)估算總脂含量需要進行預(yù)先驗證才是可靠的。正確利用該方法能夠快速測定微藻總脂含量，為能源微藻總脂測定開辟了一種新的途徑。

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Phosphoricacid-vanillindeterminationoftotalfatcontentofScenedesmusobliquusunderdifferentcultivationconditions

ZHANG Man1, GAO Xiaolong1, ZHANG Li2, ZHU Weixia2

(1.College of Fisheries, Henan Normal University, Xinxiang 453007, Henan, China；2.Henan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhengzhou 450003, China)

The reliability of measuring total fat content ofScenedesmusobliquususing the phosphoric acid-vanillin reaction under different nitrogen (0.2, 2, 20, 40 mg/L) and phosphorus (0.1, 1, 10, 20 mg/L) mass concentration cultural conditions was studied. The results showed that there were significantly linear regression relationships between total fat content and absorbance value of phosphoric acid-vanillin determination under different nitrogen and phosphorus mass concentrations (different nitrogen mass concentration conditions:R=0.997,P=0.003; different phosphorus mass concentration conditions:R=0.994,P=0.006). This method was accurate and reliable under different phosphorus and nitrogen mass concentrations. It could be used to determine the total fat content ofScenedesmus. The color intensity of phosphoric acid-vanillin reaction was associated with the saturation degree of fatty acids. Therefore, the range of nitrogen and phosphorus mass concentration should be verified to ensure the accuracy before using this method.

microalgae; total fat content; phosphoric acid-vanillin reaction; determination method

2016-10-08；

：2017-02-16

國家自然科學(xué)基金(31400397)；河南省教育廳資助項目(14B240004)；河南師范大學(xué)博士啟動金資助項目(QD13048)。

張 曼(1982)，女，副教授，博士，主要從事水域生態(tài)學(xué)研究工作(E-mail)zm0378@163.com。

TS222; Q949

：A

：1003-7969(2017)07-0120-04