齊 勇, 王 際 輝, 葉 淑 紅, 王 晗, 陳 富 遠(yuǎn)

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 遼寧省食品生物技術(shù)重點實驗室, 遼寧 大連 116034; 2.大連礎(chǔ)明集團(tuán)有限公司, 遼寧 大連 116021 )

0 引 言

酯酶(Esterase,EC 3.1.1.1)屬于水解酶類,是一類能催化水解羧酸酯的所有酶的總稱,廣泛存在于動植物體內(nèi)[1]。酯酶具有良好的不對稱選擇性,可以專一性地制備許多化學(xué)法難以合成的手性化合物(如光學(xué)活性藥物、農(nóng)藥等)及其前體[2]。近年來,國內(nèi)外對于動植物來源的酯酶報道較多,對于微生物來源的酯酶研究較少。自然界中產(chǎn)酯酶的微生物分布十分廣泛[3],但對微生物菌種、產(chǎn)酶條件、分離純化及酶的特性等基礎(chǔ)性研究均處于初級階段,主要原因是對酯酶研究不廣泛、不深入以及酯酶分析檢測方法的不完善。由于海洋微生物所處環(huán)境的特殊性,代謝過程中產(chǎn)生的酯酶在性質(zhì)、功能上與陸地生物有很大差異,可開發(fā)出很多新的極端酶[4-5]。微生物酯酶作為生物催化劑,具有很高的底物特異性和反應(yīng)特異性,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、食品及環(huán)保等領(lǐng)域[6]。

本文選用一株從渤海灣遼河口海區(qū)分離的芽孢桿菌,通過單因素試驗,采用Box-Benhnken中心組合設(shè)計及響應(yīng)面分析法,對菌株產(chǎn)酯酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,以期獲得更大的酶產(chǎn)量,使酯酶的應(yīng)用更具有現(xiàn)實意義。

1 試 驗

1.1 菌 種

菌種:實驗室保存,分離于渤海遼河入?？诤^(qū)。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10.0,NaCl 15.0,牛肉膏10.0,蛋白胨10.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):麥芽糖10.0,蛋白胨2.50,酵母膏1.50,NaNO31.2,KH2PO43.0,K2HPO46.0,MgSO4·7H2O 0.2,CaCl20.05,MnSO4·H2O 0.01,ZnSO4·7H2O 0.001。

1.3 主要試劑及儀器

α-乙酸萘酯(α-NA)、α-萘酚(α-NP),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；UV755B紫外分光光度儀,上海精密科學(xué)儀器有限公司；SIM-F124三洋制冷機(jī),日本三洋電子有限公司；JY99-2D超聲波細(xì)胞破碎機(jī),寧波新芝科器研究所。

1.4 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng):在裝液量為10%的250 mL的三角瓶中進(jìn)行,30 ℃,180 r/min搖床中培養(yǎng)18 h。

搖瓶培養(yǎng):按一定比例將種子液接種到裝有25 mL的250 mL三角瓶中,搖床培養(yǎng)。發(fā)酵液經(jīng)4 ℃,10 000 r/min高速冷凍離心后,取上清液測定酶活。

1.5 酯酶酶活測定[7]

取離心上清液酶樣1.0 mL,加至7.0 mL稀釋底物乳液中37 ℃保溫60 min,加2 mL 4%三氯乙酸使溶液總體積至10 mL,終止反應(yīng)。以沸水水浴中失活的酶液代替原酶液作空白實驗調(diào)零。各吸取6.0 mL,加新配固藍(lán)B顯色劑2.0 mL,37 ℃顯色15 min,室溫下比色。由所測得的A495值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得產(chǎn)物生成量(μmol α-NP)。

酯酶酶活單位定義:37 ℃條件下,每小時生成1 μmol α-萘酚 (α-NP)為1個酶活單位(U)。

1.6 響應(yīng)面法試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上,應(yīng)用Box-Benhnken中心組合進(jìn)行三因素三水平的試驗設(shè)計,以酯酶酶活為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面法[8]進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)溫度對酯酶產(chǎn)量的影響

將芽孢桿菌LJ-7接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,分別在20、25、30、35、40、45 ℃溫度下培養(yǎng),實驗結(jié)果見圖1。由圖1可見,當(dāng)溫度低于20 ℃時酶活相對較低,隨著溫度的增加,30 ℃時酶活達(dá)到最大值,為19.88 U/mL。當(dāng)溫度升高到45 ℃以上時,酶活下降很快,高溫不利于酯酶產(chǎn)量的積累。

圖1 培養(yǎng)溫度對酯酶產(chǎn)量的影響

2.2 培養(yǎng)基初始pH對酯酶產(chǎn)量的影響

設(shè)計pH 5.0～8.0梯度遞增的培養(yǎng)基,30 ℃搖床培養(yǎng)。酶活測定結(jié)果如圖2所示,酸性條件會比較有利于酯酶的積累。堿性條件下,酶產(chǎn)量較少。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為6.0時酶活最大為20.96 U/mL。

圖2 培養(yǎng)基初始pH對酯酶產(chǎn)量的影響

2.3 發(fā)酵時間對酯酶產(chǎn)量的影響

將芽孢桿菌LJ-7接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,30 ℃,pH 6.0搖床培養(yǎng),26、30、34、38、42、46 h后,測定發(fā)酵液的酶活,結(jié)果見圖3。由圖3可知,酶活的大小隨發(fā)酵時間的增長呈上升趨勢,當(dāng)培養(yǎng)時間為34～42 h時,酶活達(dá)到最大,培養(yǎng)時間為42 h,酶活最高達(dá)23.66 U/mL。但是隨著發(fā)酵時間的繼續(xù)增加酶活呈下降趨勢。可能隨著菌體的逐漸死亡和發(fā)酵液中次級代謝產(chǎn)物的增加,會影響酶穩(wěn)定性,造成酶失活,從而使發(fā)酵液酶活降低。

圖3 發(fā)酵時間對酯酶產(chǎn)量的影響

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化

在發(fā)酵條件選取的基礎(chǔ)上,確定Box-Benhnken設(shè)計的自變量,以X1=(Z1-42)/3,X2=(Z2-30)/5,X3=Z3-6為自變量,以酯酶酶活為響應(yīng)值,運用Minitab 15數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面分析,響應(yīng)面因素水平設(shè)計見表1,響應(yīng)面分析結(jié)果見表2。

表1 酯酶酶活響應(yīng)面分析因素與水平

Tab.1 Factors and levels of central composite design test on esterase activities

因素水平-101發(fā)酵時間(X1)394245發(fā)酵溫度(X2)253035初始pH (X3)5.06.07.0

各因素經(jīng)回歸擬合后,解得回歸方程為:

Y=23.744 3+0.179 375X1-0.077X2-

0.096 625X3-0.349 417X1X1-

0.234 167X2X2-0.204 917X3X3-

0.162 250X1X2-0.049 5X1X3-

0.022 75X2X3

式中,R2=0.922 0,Y為酯酶酶活,X1為發(fā)酵時間(h),X2為發(fā)酵溫度(℃),X3為初始pH。

表2 酯酶酶活響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

Tab.2 Design scheme and results of central composite test on esterase activities

試驗號X1X2X3酶活/(U·mL-1)110-123.5772-11022.971 30-1-123.299410123.046501123.266 6-10-123.2357-1-1022.876801-123.266900023.757 1000023.816 1100023.660120-1123.390 131-1023.675 14-10122.9021511023.121

由回歸方程的線性相關(guān)系數(shù)說明回歸方程合理,可以用于實際控制和應(yīng)用。從回歸分析表中可以看出,方程一次項、二次項的影響都是顯著的,交互項作用影響不顯著,故交互項可以省略,也可以看出各具體試驗因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。

圖4～6直觀地反映了各因子交互作用的響應(yīng)面的分析圖。比較響應(yīng)面最高點可知,在所選范圍內(nèi)存在極值,即響應(yīng)面最高點,同時也是等值線最小橢圓的中心點。

圖4 發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對酯酶酶活影響的等高線圖及響應(yīng)面圖

圖5 發(fā)酵時間和初始pH對酯酶酶活影響的等高線圖及響應(yīng)面圖

圖6 發(fā)酵溫度和初始pH對酯酶酶活影響的響應(yīng)面圖

對回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)等于零,可得到3個方程:

0.179 375-0.698 834X1-0.162 250X2-0.049 5X3=0

-0.077-0.468 334X2-0.162 250X1-0.022 75X3=0

0.096 625-0.409 834X3-0.049 5X1-0.022 75X2=0

聯(lián)立方程解得X1=0.269 692,X2=-0.120 08,X3=0.209 86,根據(jù)轉(zhuǎn)換式解得Z1=42.809 80,Z2=29.399 6,Z3=6.209 86,因此考慮實驗和工業(yè)生產(chǎn)的可行性,模型推算的芽孢桿菌LJ-7發(fā)酵產(chǎn)酯酶的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時間42.81 h,發(fā)酵溫度為29.40 ℃,pH為6.21,由回歸方程得到的酯酶酶活的理論值為24.91 U/mL。

2.5 驗證性試驗

為了驗證響應(yīng)面法的可行性,采用得到的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行驗證試驗,3次平行試驗得到實際平均酶活為24.63 U/mL,實際酶活超過理論預(yù)測值的95%,十分接近,該模型較好地預(yù)測了實際發(fā)酵情況。由結(jié)果可知,響應(yīng)面法對發(fā)酵產(chǎn)酯酶條件的優(yōu)化是可行的,得到的優(yōu)化條件具有實際應(yīng)用價值。

3 結(jié) 論

本實驗采用Box-Benhnken中心組合設(shè)計,利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化芽孢桿菌LJ-7產(chǎn)酯酶發(fā)酵培養(yǎng)條件,獲得了產(chǎn)酯酶的最優(yōu)條件:發(fā)酵時間42.81 h,發(fā)酵溫度為29.40 ℃,pH為6.21。在此條件下,酯酶酶活達(dá)到了24.63 U/mL。

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